Metabolismo Microbiano Produção de Energia e Biossíntese Brock, Caps. 05 e 06 Conceitos básicos Classes microbianas Quimiotrofia Fototrofia Quimiolitotróficos Integração metabólica

Introdução Metabolismo: São de 2 tipos: toda a atividade química realizada por um organismo e seu maquinário. São de 2 tipos: aquelas que liberam E = exergônicas - catabólicas aquelas que utilizam E = endergônicas - anabólicas E = capacidade de realizar trabalho química luminosa E

∆G = + ∆G = - Catabólica Anabólica

Produção de Energia (E) Requerimentos de energia: Componentes celulares: parede, membrana, etc. Síntese de enzimas, ácidos nucléicos, polis-sacarídeos, fosfolipídios, etc. Reparos e manutenção da célula Crescimento e multiplicação Acumulo de nutrientes e excreção de produtos indesejáveis Mobilidade

Degradação Síntese Crescimento celular, reprodução, manutenção Sistema de armazenamento e transferência de E Componentes celulares como proteínas (enzimas), DNA, RNA, carboidratos, lipídeos, etc. Produtos da degradação servem como unidades para a produção de compostos celulares Síntese Compostos e estruturas Degradação Quebra de substratos ou nutrientes E liberada E requerida Crescimento celular, reprodução, manutenção e movimento

Classificação dos microrganismos de acordo com a fonte de energia e carbono CO2, HCO3, CO32- Fauna, fungos, maioria das bactérias CO2, HCO3, CO32- Extraída de: Moreira & Siqueira, 2006

Compostos ricos em energia: armazenamento e transferência de energia (imediata) ATP = adenosina trifosfato ADP = adenosina difosfato Fosfoenolpiruvato Glicose-6-fosfato Coenzimas: Acetil CoA, NAD, NADH, NADPH

Armazenamento de energia Ligacoes tioéster (Madigan et al., 2010)

O ATP é o composto de alta energia mais importante nos seres vivos. Apesar disso, sua concentração nas células é relativamente baixa. Para o armazenamento de energia por períodos longos, os microrganismos produzem polímeros insolúveis. Ex.: polímeros de glicose (amido e glicogênio), polímeros lipídicos, PHAs (biopoliéster). Ralstonia eutropha

Compostos ricos em energia: armazenamento e transferência de energia (a longo prazo) Procariotos: Glicogenio Poli-β-hidroxibutirato Poli-idroxialcanoatos S (elementar) Eucariotos Poliglicose na forma de amido Lipídeos na forma de gorduras

Geração de ATP por microrganismos Ausência de aceptores exógenos de elétrons O2 ou outro composto como aceptor exógeno de elétrons Menos E Mais E Fermentação Respiração Síntese de ATP acoplada a reações de óxido-redução Oxidação = perda de e- (liberam energia) Redução = ganho de e- (requerem energia)

Mecanismos para conservação de energia (Síntese de ATP) Os quimiotróficos apresentam dois mecanismos conhecidos: 1. Respiração: atuam aceptores externos de elétrons (fosforilação oxidativa) Podendo ser: a) Aeróbia: o aceptor externo é o oxigênio b) Anaeróbia: aceptores diferentes do oxigênio (nitrato, sulfato, carbonato, ...) 2. Fermentação: ocorre na ausência de aceptores externos de elétrons (fosforilação a nível de substrato) 1a) Respiração aeróbia É o procedimento mais comum às células e compreende 3 etapas: Piruvato (glicólise quando o substrato é a glicose) Ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs) Cadeia respiratória

1ª etapa: Piruvato (via glicolítica) É considerada a via metabólica mais primitiva, presente em todas as formas de vida atuais. Ocorre no citoplasma das células. Características: Oxidação parcial da glicose a piruvato Pequena quantidade de ATP é gerada (produção líquida de 2 ATP) Pequena quantidade de NAD é reduzida a NADH

2ª etapa: Ciclo de Krebs Ocorre no citoplasma (procariotos) e nas mitocôndrias (eucariotos). Reações preparatórias: formação de composto chave do processo Produção direta de 1 GTP guanosina trifosfato (equivalente ao ATP) Além do papel-chave nas reações catabólicas, é importante nas reações biossintéticas. Os intermediários são desviados para vias biossintéticas quando necessário: Exemplos: Oxalacetato: precursor de aminoácidos Succinil-CoA: formação de citocromos e da clorofila, entre outros Acetil-CoA: biossíntese de ácidos graxos

3ª etapa: Cadeia respiratória (sistema de transporte de elétrons) Ocorre ao nível da membrana das mitocôndrias (eucariotos) e na membrana citoplasmática (procariotos) Os prótons e elétrons recolhidos na glicólise pelo NAD e no Ciclo de Krebs pelo NAD e FAD são transportados ao longo de uma cadeia de citocromos em níveis sucessivamente mais baixos de energia de modo que seja melhor aproveitada na formação de ATP.

Fosforilação oxidativa Exterior da célula Citoplasma

As 3 etapas da via respiratória

Síntese da respiração aeróbia Produção de ATP: Na cadeia respiratória: 4 NADH formados na glicólise geram 12 ATP 6 NADH formados no ciclo de Krebs geram 18 ATP 2 FADH formados no ciclo de Krebs geram 4 ATP Formação direta na Glicólise 2 ATP Formação direta no Ciclo de Krebs 2 GTP Total de até .................................................... 38 ATP

1b) Respiração anaeróbia É uma variação alternativa da respiração aeróbia: o aceptor de elétrons não é o oxigênio. Uma implicação é o rendimento energético inferior: nenhum aceptor alternativo apresenta potencial tão oxidante quanto O2. O uso de aceptores alternativos permitem os microrganismos respirarem em ambientes sem oxigênio, sendo de extrema importância ecológica. Oxidação de substratos orgânicos ou inorgânicos: C6H12O6 + 12 NO3-  6CO2 + 6H2O + 12NO2- 2 lactato + SO4= + 4H+  2 acetato + 2CO2 + S= + H2O Quantidade de energia produzida é menor

2. Fermentação (também é uma forma de respiração anaeróbia 2. Fermentação (também é uma forma de respiração anaeróbia. Ocorre no citossol) Reação de oxidação-redução internamente balanceada. Ausência de aceptores externos. A concentração de NAD+ nas células é baixo, precisando ser re-oxidado para não cessar a via glicolítica. A redução do piruvato a etanol ou outros produtos restabelece o NAD e permite a continuidade da glicólise . Produção líquida de apenas 2 ATP.

Este é o processo básico na indústria de produção de bebidas alcoólicas

Produtos da fermentação Espécie microbiana Principal produto da fermentação Acetivibrio cellulolyticus Ácido acético Actinomyces bovis Ácidos acético, fórmico, láctico, etc. Clostridium acetobutylicum Acetona, butanol, etanol, ácido fórmico, etc. Enterobacter aerogenes Etanol, ácido fórmico, CO2, etc. Escherichia coli Etanol, ácidos láctico, acético, fórmico, succínico, etc. Lactobacillus brevis Etanol, glicerol, CO2, ácidos láctico, acético, etc. Streptococcus lactis Ácido láctico Succinimonas amylolytica Ácidos acético e succínico

Fermentações

Biossíntese Energia para síntese de compostos celulares: ácidos nucléicos (DNA, RNA), substâncias nitrogenadas (aa, enzimas, proteínas), carboidratos (peptidoglicano), lipídeos, etc. ATP para processos como divisão celular, mobilidade, transporte ativo de nutrientes, etc.

Utilização de energia

Nutrição e Crescimento Microbiano Nutrição microbiana Componentes necessários às células Meios de cultura Condições ambientais Crescimento populacional Velocidade de crescimento Tempo de geração Medidas do crescimento

Necessidade de elementos nutricionais Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade (C, N, H, O, S, P) - Tem papel importante na estrutura e metabolismo. Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas (B, Co, Cr, Cu, F, I, Mn, Mo, Se, Zn) - Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas célula

Componentes necessários às células Macronutrientes Fonte de carbono: - Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): carboidratos lipídeos proteínas - Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou de outros compostos inorgânicos. Fonte de Nitrogênio: - É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %. (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.) moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos) moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2) A capacidade de algumas bactérias em utilizar o nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida de todos os seres.

Componentes necessários às células Hidrogênio: Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) Função: Manutenção do pH Formação de ligações de H entre moléculas Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração Oxigênio: - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos) - É obtido a partir das proteínas e gorduras. Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.

Componentes necessários às células Outros macronutrientes: P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas K – Estabilidade dos ácidos nucléicos, bomba de Na/K Mg – Estabilidade dos ribossomos Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15 % de sal. Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.

Componentes necessários às células Micronutrientes Metais em quantidades muito pequenas (traços): Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B ► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação) Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte o N2 para NH3 durante a FBN.

Curva de crescimento Microbiano Fases de crescimento: lag, exponencial (log), estacionária, declínio

Crescimento microbiano Expressão matemática do crescimento progressão geométrica de quociente 2: 1 2 4 8 16 32 ......... X 2º 21 22 23 24 25 ......... 2n

Crescimento microbiano Tempo de geração: tempo necessário para a divisão das células depende da espécie e das condições de crescimento g = t/n, onde: g = tempo de geração t = tempo de crescimento n = número de gerações dentro de um tempo t de crescimento E. coli: 6-20 min

5 x 107

Crescimento microbiano população final (N) = N0 x 2n A relação entre o número de células e de gerações pode ser expressa em uma série de equações matemáticas: sendo a população inicial = N0 1ạ geração N = N0 x 21 2ạ geração N = N0 x 22 3ạ geração N = N0 x 23 nạ geração N = N0 x 2n população final (N) = N0 x 2n

Crescimento microbiano população final (N) = N0 x 2n A relação entre o número de células e de gerações pode ser expressa em uma série de equações matemáticas: sendo a população inicial = 5 1ạ geração N = N0 x 21 = 5 x 2 = 10 2ạ geração N = N0 x 22 = 5 x 22 = 20 3ạ geração N = N0 x 23 = 5 x 23 = 40 nạ geração N = N0 x 2n = 5 x 2n população final (N) = N0 x 2n

Medidas do crescimento Medidas diretas Contagem de células totais Câmaras de Petroff-Hausser e de Neubauer Contagem dos viáveis

Medidas do crescimento Contagem microscópica direta: Câmara de Petroff-Hausser

Medidas do crescimento Contagem dos viáveis Superfície Pour plate

Contagem dos viáveis utilizando a técnica das diluições em série

Medidas do crescimento Medidas indiretas Turbidez

Fatores que afetam o crescimento Fatores químicos: pH: neutrófilos – pH ≈ 7.0 acidófilos – pH < 7.0 alcalófilos – pH > 7.0 Importância: Atividade enzimática Conformação protéica Disponibilidade de metais e elementos orgânicos

Archaea acidofílica – área de mineração ácida (extração de ouro, etc.)

Vermiculita Rochas calcáricas

Fatores que afetam o crescimento Fatores químicos: O2: Aeróbios obrigatórios Anaeróbios obrigatórios Anaeróbios facultativos Microaerófilos Aerotolerantes Importância: Respiração e produção de energia Reações de óxido-redução Atividade enzimática

aeróbios anaeróbios anaeróbios microaerófilos anaeróbios obrigatórios obrigatórios facultativos aerotolerantes

Fatores que afetam o crescimento Fatores físicos: Temperatura: Psicrófilos: - 5 C a 20 C Mesófilos: 20 C a 50 C Termófilos: 50 C a 80 C Termófilos extremos: acima de 80 C Importância: Altera as respostas enzimáticas Altera as respostas a choques térmicos Influencia na razão de crescimento

Chlamydomonas nivalis

Fatores que afetam o crescimento Estratégias de adaptação às altas temperaturas membranas ácidos graxos diferenciados: Archaea não tem ácidos graxos nas membranas (têm hidrocarbonetos C40 com unidades de isopropeno) monocamada lipídica

Bicamada lipídica Monocamada lipídica

Fatores que afetam o crescimento Estratégias de adaptação às altas temperaturas proteínas tipo de aminoácido: conferem conformação distinta (Glu, Lys, Arg) velocidade de renovação das células Taq polimerase (Thermus aquaticus) ácidos nucléicos maior concentração de C≡G

Fatores que afetam o crescimento Fatores físicos: Pressão osmótica (NaCl): Halotolerantes Halófilos Halófilos extremos Pressão hidrostática Barotolerantes Barófilos

Halofílicas extremas Habitat de Archaea: Great Salt Lake (2460 km2, Utah, EUA

Halofílicas extremas Evaporadores na Baía de São Francisco, Califórnia, EUA

Fatores que afetam o crescimento Fatores biológicos: Fauna e o substrato Processos de ingestão Ciclagem de nutrientes Composição da comunidade Interações microbianas Neutralismo Comensalismo Sinergismo Mutualismo Biodisponibilidade Adsorção Solubilidade Especiação química Competição Amensalismo/Antagonismo Parasitismo Predação