Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Práticas Bibliografia Microscopia de transmissão Microscopia de fluorescência wide-field Microscopia confocal Bibliografia Lakowicz, J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd Edition. 1999. Kluver Academic/Plenum Publishers, New York. Lichtman, J.W., Conchello, J-A. Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12):910- 919, 2005. Conchello, J-A., Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods, 2(12):920-931/ Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Ondas mecânicas em um meio elástico Massa (inércia) Elasticidade Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Carregam energias elétrica e magnética Propriedades do meio de propagação: Armazenar energia elétrica (capacitância) Armazenar enérgia magnética (indutância) Vácuo Permitividade e0=8.85*10-12F/m Permeabilidade m0=4p*10-12 H/m Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Velocidade da onda Frequência (ciclos por s, Hz) Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Espectro da radiação eletromagnética Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Onda: Refração Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Fóton photon is the quantum of the electromagnetic interaction and the basic "unit" of light and all other forms of electromagnetic radiation and is also the force carrier for the electromagnetic force. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Interação radiação EM-matéria: reflexão Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Interação radiação EM-matéria: refração Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Interação radiação EM-matéria: difração Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Luminescência – Fluorescência e fosforescência Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Luminescência – Fluorescência e fosforescência Diagrama de Jablonski Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Fluoróforos de interesse em Biologia Quinina lexc 250nm 350nm lem =450nm Fluoresceína lexc=490nm lem=514nm Rodamina Acridina lexc=495nm lem=526nm lexc=530nm lem=556nm Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Fontes de “luz”: Laser x HBO Espectro do He-Ne laser Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente (fase relativa constante), em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático) Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscopia Confocal: Teoria e técnica 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Dimensões na Biologia Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscopia - Objetivas Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Abertura numérica e aumento Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Resolução Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Difração limita a resolução – Airy disks Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Resolução e refração do meio Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Resolução Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Aumento e Resolução Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscopia de luz refletida Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscopia de luz transmitida Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Iluminaçao – Sistema Köhler Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Técnicas especiais: Contraste por Interferência Diferencial DIC Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Técnicas especiais: Contraste por Interferência Diferencial DIC Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Imagem de Fluorescência em Microscopia “Wide Field” Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Fluorescência Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscopia de fluorescência “wide field” Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Imagem de Fluorescência em “Wide Field” “Filter Cube” Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Imagem de Fluorescência Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscópio de epifluorescência “Wide Field” UV Filter Cube set #487902 (Exciter Filter: G 365, Beam Splitter: FT 395, Barrier Filter: LP 420). This cube is used to visualize UV-excitable fluors like DAPI. Blue Filter Cube set #487910 (Exciter Filter: BP 450-490, Beam Splitter: FT 510, Barrier Filter: BP 515-565). Fluorescein, GFP and Oregon Green can be visualized using this filter set. Green Filter Cube set #487915 (Exciter Filter: BP 546±12, Beam Splitter: FT 580, Barrier Filter: LP 590). Green-excitable fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized using this filter set. Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Espectro da HBO Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Zeiss Axiovert 100 M Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola
Microscópio Confocal Microscópio de fluorescência a laser com iluminação puntiforme Microscópico de varredura Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da epifluorescência Resolução no eixo Z Resolução temporal reduzida. Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscópio Confocal: aplicaçoes As que demandam resoluçao espacial XYZ Investigação de colocalização de moléculas que possam ser identificadas por indicadores fluorescentes Análise da interação entre moléculas (FRET) Análise da migraçao de moléculas (FRAP) etc Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscopia confocal Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Princípio da Microscopia confocal A. C. Cassola
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Imagem multiespectral Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Resoluções lateral e axial Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Resolução e “Airy pattern” Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Compromissos Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Aplicações do microscópio confocal Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Espectros das FP Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola
Inclusões Análise espectral – META (lambda stack - AOTF) Proteínas fluorescentes (http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/index.htm) Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola