PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇAO EM GESTÃO AMBIENTAL-UFES Avaliação de Bioindicadores de Qualidade de águas Prof. Servio Tulio Cassini Labsan - PPGEA-UFES - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambienta/UFES

Microbiologia de Águas Tipos e Usos das Águas Legislação Metodologias Tubos Multiplos (NMP) Membrana Filtrante (MF) Substrato Cromogênico (SC) Exemplo de Biomonitoramento de ambiente costeiro (Vitoria, E.S.)

Principais Tipos e Usos das Águas Abastecimento Doméstico Irrigação Recreacional “Produto Comercial” Lançamentos “Reuso”

DOENÇAS DE VEICULAÇÃO HÍDRICA Pseudomonas Fonte: Efstratiou (2001)

OS BIOINDICADORES Indicam a POSSIBILIDADE de ocorrência de patógenos na amostra Ocorrencia simultanea com patógenos com a presença de fezes  esgotos domesticos Muito caro e trabalhoso ( talvez impossível) avaliar diretamente TODOS os patógenos nas amostras de águas.

Indicador Biológico Ideal Presente em todos os tipos de água Ocorrência e desaparecimento concomitante com patogênicos Densidade populacional diretamente relacionada com o grau de contaminação Maior sobrevida que a dos patogênicos Ausência em água potável Fácil detecção e recuperação laboratorial Não prejudicial à pessoas e animais Manipulação segura

Bioindicadores Utilizados Coliformes totais Coliformes Termotolerantes (fecais) Coliforme específico: Escherichia coli Estreptococcus fecais (Enterococcus) Pseudomonas aeruginosa ovos de helmintos

“Coliformes” Bacilos Gram-negativos não esporulados Aeróbios ou Anaeróbios facultativos Fermentam a lactose com produção de gás (48 h a 35oC ou 44,5 oC) Desenvolvem colônias vermelhas com brilho verde metálico (24 h a 35oC) em meio Endo contendo Lactose Apresentam atividade de B-galactosidase (enzima que desdobra a lactose ou substratos análogos tais como o ONPG desenvolvendo cor amarelada no meio)

Coliformes “Ambientais” Grupo Coliforme Indicador referenciado na legislação Além da E. coli inclui os gêneros: Klebsiella Enterobacter Citrobacter Coliformes “Ambientais”

Coliformes Termotolerantes XI - coliformes termotolerantes: bactérias gram-negativas, em forma de bacilos, oxidase-negativas, caracterizadas pela atividade da enzima -galactosidase. Podem crescer em meios contendo agentes tenso-ativos e fermentar a lactose nas temperaturas de 44º - 45ºC, com produção de ácido, gás e aldeído. Além de estarem presentes em fezes humanas e de animais homeotérmicos, ocorrem em solos, plantas ou outras matrizes ambientais que não tenham sido contaminados por material fecal; ANTIGAMENTE E ERROONEAMENTE DENOMINADAS COLIFORMES FECAIS

Grupo Coliforme: coliformes totais e fecais (termotolerantes) O GRUPO COLIFORME Bactérias Entéricas: (Gram + ou -) Ex: Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, e Enterococcus faecalis Enterobacteriaceae : (Gram -). Gêneros: E.coli, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus Grupo Coliforme: coliformes totais e fecais (termotolerantes) Termotolerantes: E. coli, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter. E. coli E.coli

Resumo: Enterobactérias e Coliformes Coliformes Totais ou “Ambientais” Coliformes fecais Escherichia coli

Bioindicador referenciado na legislação Enterococcus Bioindicador referenciado na legislação CONAMA 274/2000 Características: Cocos Gram (+) grupo Estreptococos fecais Intestino de Animais homeotermicos ---> poluição fecal > Tolerancia a ambientes marinhos

Legislação Qual. Águas CONAMA 20/86  357 17/03/2005 Nova Legislação CONAMA 20/86  357 17/03/2005 Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes, e dá outras providências. 274/2000 Dispõe sobre a qualidade das águas, em relação aos níveis estabelecidos para a balneabilidade, de forma a assegurar as condições necessárias à recreação de contato primário; MS 36/90 -------> 1469/2000 Especifica os requisitos de amostragem e analises de aguas de abastecimento público OMS 1993  Recomendações

PADRÕES DE BALNEABILIDADE RESOLUÇÃO CONAMA 274/2000 Legenda: as águas na categorias excelente, muito boa e satisfatória são assim consideradas em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtida em cinco semanas, no mesmo local. * valor obtido na última amostragem 1 Padrão da Legislação CONAMA 20/86.

LEGISLAÇÃO DE BALNEABILIDADE NO BRASIL E NO MUNDO Fonte: Adaptado de Efstratiou apud WHO/ US EPA (1999). Legenda: número de microrganismos/100ml.

Cuidados na coleta Colher a amostra em recipiente esterilizado Até 4/5 da capacidade do frasco Água com cloro: 0,1 ml de tiossulfato a 10% Água bruta que contenha metais pesados: 0,3 ml EDTA a 15%

METODOLOGIAS MAIS UTILIZADAS PARA REALIZAÇÃO DOS TESTES MICROBIOLÓGICOS  Tubos Múltiplos  Membrana Filtrante  Substrato Cromogênico

Tubos Múltiplos (NMP) (Procedimento p/ 5 ou 10 Tubos) Presuntivo Inocular tubos com Caldo Lauril Triptose 24±2 hrs @35 ± 0.5º C Presuntivo Gás/ácido=Positivo Sem gás / ácido=Negativo Incubar mais 24 hr (48±3 hr total) Transfere p/ Caldo Verde Brilhante Incubar 48 ±hrs/35 º C Confirmativo Gás/ ácido Sem gás=Negativo Gás=Positivo Sem gás=Negativo Continua com ensaio completo

Coliforme positivo para 2 tubos Tubos Múltiplos - NMP Diagnóstico: Coliforme positivo para 2 tubos

NMP: teste confirmativo

Metodologia da Membrana Filtrante (MF)

Suportes de filtração de polissulfona, vidro e aço de 47 mm manifold de PVC e bomba vácuo

Como funciona a membrana filtrante

Caldo m- Endo / Coliformes Totais Típicas (Brilho metálico) Atípicas

Meio m-FC para detecção de Coliformes fecais

Metodologia com Substrato Cromogênico / Fluorogênico Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose (glicopiranosídeos) processados somente por Escherichia coli. Exemplos: ONPG: Orto Nitrofenil galactopiranosídeo e MUG: Metil-Umbeliferone Galactopiranosídeo Ferramenta poderosa para indentificação de Escherichia coli (teste confirmativo)

Detecção de Coliformes em Amostras De Águas

Incubação por 24 h. Resultados Amarelo Coliforme total +; Teste P/A Incubação por 24 h. Resultados Incolor: Negativo; Amarelo Coliforme total +; Azul Coliforme E. coli + Adição do meio com substrato à amostra

Teste Quantitativo 1 5 Mesmas placas amarelas submetidas a luz ultra-violeta (UV) Resultado Azul  Ecoli Se (-) e amarelo  C. Total Negativo amarelo e positivo azul  anomalo (impossível) 4 2 3 Tabelas de NMP Resultados em numeros/100 ml 6

Projeto Labsan-FACITEC 2000-2001 Resultados de Biomonitoramento da Praia de Camburi Vitoria - ES Projeto Labsan-FACITEC 2000-2001

Bioindicadcadores Utilizados Coliformes Totais Coliformes Fecais E. Coli Enterococus Candida (Levedura) --> areia

ÁREA DE ESTUDO: PRAIA DE CAMBURI/ VITÓRIA/ES. MATERIAL & MÉTODOS: ÁREA DE ESTUDO: PRAIA DE CAMBURI/ VITÓRIA/ES. 1, 1A e 1B 2, 2A e 2B 9, 9A Fonte: www.pmv.es.gov

METODOLOGIAS Análises bacteriológicas segundo APHA (1995):  CF meio A1,  CT e E.coli Colilert®,  Enterococos Enterolert®,  Candida meio BIGGY. Análise de Candida com MF Cartelas do teste Colilert

Médias Geométricas dos Bioindicadores Coliformes Totais Coliformes Fecais E.coli Enterococos

Enterococos/Primavera Enterococos/Verão Enterococos/Outono Enterococos/Inverno Enterococos/Primavera

COMPARAÇÃO ENTRE INDICADORES Amostragens realizadas na praia de Camburi durante as estações do ano em cinco semanas consecutivas, classificação quanto as categorias de própria (na água: Excelente, Muito Boa e Satisfatória) e impropria para água e areia de acordo com a Resolução CONAMA e Limite Proposto em Portugal respectivamente. Legenda: V(verão), O (outono), I (inverno), P (primavera); I (impróprio), P (próprio), E (excelente), S (satisfatório), MB (muito boa)

Amostragens na praia de Camburi durante as estações do ano, em cinco semanas de monitoramento para a levedura do gênero Candida de acordo com o Limite Proposto em Portugal. Legenda: O (outono), I (inverno), P (primavera), P (próprio). Os números representam a frequencia em que o ponto amostrado ficou impróprio em cada estação do ano.

Agradecimentos: UFES (CT-DHS) Laboratório de Saneamento CT-DHS Microbiologistas “tipo coliformes” e... Sua paciência M. Obrigado