CARACTERIZAÇÃO DE HIPOTÉTICAS PROTEÍNAS CONSERVADAS DE CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum sp.) INTRODUÇÃO A aquisição de informação genética de espécies com genomas complexos, como a cana-de- açúcar, é um difícil trabalho, pois atualmente os cultivos são de híbridos, resultando, portanto, em um mosaico de cromossomos. Uma poderosa estratégia para acessar os genes de muitas espécies tem sido o uso de ESTs (expressed sequence tags), obtidos de seqüenciamento de cDNAs. A identificação desses genes é fortemente dependente de ferramentas de bioinformática. As funções de proteínas deduzidas de projetos ESTs são geralmente inferidas por similaridade com proteínas presentes em bancos de dados. Entretanto, grande fração de proteínas deduzidas em muitos genomas não foi ainda caracterizada, como 31% em Arabidopsis, 41,7% em humanos e 51,4% em cana-de-açúcar. Apesar dos algoritmos utilizados serem diferentes, os números claramente indicam que a função de muitos genes ainda precisa ser determinada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar hipotéticas proteínas da cana utilizando ferramentas da Bioinformática e Biologia Molecular, a partir de dados provenientes do projeto EST da cana-de-açúcar (SUCEST). Os resultados poderão aumentar o conhecimento sobre os genes codificadores de proteínas com função desconhecida, podendo alguns destes serem usados no aprimoramento do cultivo da cana através do uso de plantas transgênicas. MATERIAIS E MÉTODOS Foram selecionados 100 clusters com maior números de ESTs. ORFs (Open Reading Frames) foram identificadas usando o programa ORF Finder. Algoritmos públicos foram usados para inferir a localização celular (TargetP, Predotar e PredictNLS), a presença de hélices transmembranas (SOSUI) e domínios conservados (CDsearch). Um script para analisar o padrão de expressão foi desenvolvido e a abundância de transcritos nos tecidos da cana-de-açúcar foi inferida pelo número de ESTs de cada biblioteca de cDNA do cluster. Tecidos de cana adulta foram obtidos de indivíduos do cruzamento de duas variedades na estação experimental Copersucar. As plantas foram classificadas de acordo com seu padrão de acúmulo de açúcar em Alto Brix (AB) e Baixo Brix (BB). Plântulas de cana em meio de cultura foram aclimatadas a uma condição de fotoperíodo de 16h dia/8h noite e à 26 o C. Depois das raízes já estarem bem desenvolvidas, as plantas foram transferidas para uma câmara à 4 o C para o ensaio de estresse por frio. Os extratos das plantas controle ( mantidas à 26 o C) e as que sofreram estresse foram colhidas em 0, 3, 6, 12, 24 e 48 horas após o tratamento. O RNA extraído foi transferido para uma membrana que foi posteriormente utilizada para a análise de Northern Blot. Oliveira, L.P. 1,2, Carvalho, R.A. 1,2, Fregolente, M.C.D. 1,, Martini, I.J. 1,, Nascimento, E.O. 1,, Tsuneda, S.S. 1,, Rodrigues Filho, P.C. 2, Freitas, J.O. 2, Vicentini, R. 1,2, Felix, J. 1,2, Tebaldi, F. 1,2, Ulian, E 3. Menossi, M. 1,2 ; 1-Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia – UNICAMP 2-Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) - UNICAMP 3- Centro de Tecnologia da Copersucar. Dos 100 clusters analisados, 76% eram completos. Essa fração, maior que 33% observado no SUCEST, provavelmente reflete o alto nível de expressão do nosso conjunto de clusters, que continham um número mínimo de 25 ESTs cada. A localização celular foi concluída analisando uma combinação de resultados baseada na eficiência de cada programa. Os resultados obtidos foram similares aos observados no genoma da Arabidopsis. A proporção de proteínas com hélices transmembranas também foi próximo às encontradas em Arabidopsis Escala (genes por ESTs) A análise do northern mostrou que o cluster SCEPLB1043A10.g, que possui um domínio transportador de açúcar, tem uma expressão superior nos entre-nós imaturos. Pode- se inferir, a partir daí, uma função de transporte de açúcar nos estágios primários de sua acumulação. O cluster SCJFLR1035G06.g, que codifica uma possível proteína de cloroplasto, tem um ortólogo em Arabidopsis que é fortemente induzido por seca e alta salinidade e, em menor grau, por frio. A expressão do northern verificou um aumento de expressão nas plantas submetidas ao estresse de 4ºC. RESULTADOS E DISCUSSÃO Tanto a análise in silico quanto a do northern demonstraram que o gene SCCCRZ1003F10.g, que tem um domínio de proteína kinase C, apresenta maior expressão em entrenó imaturo (C1), quando comparado com entrenós mais velhos (C5 e C9). Este padrão de expressão mostra que o gene tem alta expressão nos estágios primários de acumulação de açúcar. Quantificação do sinal detectado no Northern Blot da folha e entre- nós da cana-de-açúcar. Padrão de expressão de 100 genes da cana-de- açúcar com função desconhecida Expressão do gene em resposta ao estresse por frio Análise Northern Blot da expressão do gene em diferentes tecidos. AB: plantas com Alto Brix ( alto teor de sacarose); BB: plantas com Baixo Brix (baixo teor de sacarose). F: folha +1; C1: entrenó 1; C5: entrenó 5; C9: entrenó 9. O padrão de expressão foi analisado contando o número de reads que cada biblioteca de cDNA contribuiu em cada cluster. AB BB Coleta 1Coleta 2 Suporte Representação esquemática do transportador