Identificação computacional de genes de microRNA Alexandre dos Santos Cristino Bruno Augusto N. Travençolo César Beltrán Castañón Elza Helena Andrade Barbosa

Roteiro Introdução Caracterização biológica de miRNAs Predição computacional de miRNA de Drosophila Validação experimental dos candidatos à miRNA Conclusões

Introdução rRNA miRNA miRNA Interrupção

Introdução

Caracterização biológica de miRNAs O que é um microRNA (miRNA)? Nova classe de pequenos RNAs reguladores, “escondidos” no genoma (regiões intergênica e intrônica ou “DNA lixo”) Estes miRNA de 22 nucleotídeos foram descobertos em estudos de regulação do desenvolvimento de C. elegans (lin-4 e let-7) Alguns com expressão constitutiva, e outros com controle de expressão temporal- e tecido-específica

Caracterização biológica de miRNAs Inicialmente transcrito como um pré-miRNA de 70-100 pb (stem loop, hairpin, double strand) Pré-miRNA é processado pela Dicer (RNAase III) Formação de miRNA “maduro” com 21-22 nt Atua negativamente na regulação pós-transcricional pela formação de um duplex RNA, interrompendo a tradução de um RNAm pela região 3’-UTR RNAi -> silenciamento gênico

Caracterização biológica de miRNAs Loop Dicer (RNAase III) UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGU (miRNA)

Caracterização biológica de miRNAs miRNA são altamente conservados em grupos filogenéticos afastados (insetos, peixe e humano)

Predição computacional de miRNA de Drosophila Regras e parâmetros foram derivados a partir de 24 sequências de miRNA de Drosophila O alinhamento global (VISTA) entre os genomas de espécies diferentes de Drosophila mostraram alta conservação nas 24 sequências de miRNA referência.

Predição computacional de miRNA de Drosophila Alinhamento global D. melanogaster e D. pseudoobscura (VISTA plot)

Predição computacional de miRNA de Drosophila O alto grau de conservação e a formação de stem-loop não são características exclusivas dos miRNAs Portanto, foram necessários critérios adicionais, tais como determinar padrões de divergência dos nucleotídeos entre os 24 pares ortólogos

Predição computacional de miRNA de Drosophila Conservação total (3/24) Divergência nos braços (0/24) Resultado do Alinhamento Divergência em um braço (0/24) diverge no loop (10/24) Divergência no braço >> divergência no loop (1/24) Divergência no loop  divergência em um braço (10/24)

Predição computacional de miRNA de Drosophila Observações do conjunto referência (24 miRNA) indicam que os miRNAs são filogeneticamente conservados e a estrutura stem-loop demostra um padrão característico de divervêngia dos nucleotídeos. miRseeker: pipeline desenvolvido para localizar candidatos a miRNA no genoma Dividido em três partes: 1. Identificar regiões conservadas; 2. Identificar e avaliação da qualidade de stem-loops; 3. Avaliar padrões de divergência

Predição computacional de miRNA de Drosophila 1 Predição computacional de miRNA de Drosophila 1. Identificar regiões conservadas

AVID – Alinhamento Global Predição computacional de miRNA de Drosophila 1. Identificar regiões conservadas - AVID AVID – Alinhamento Global D. Melanogaster 1287 contigs D. Pseudoobscura 18000 contigs Eliminar os genes anotados, tais como: exons, transpossons, snRNA, snoRNA, tRNA, rRNA Alinhamento total resultou em 51.3 de 90.2 MB de sequências intrônicas e intergênicas

Predição computacional de miRNA de Drosophila 1 Predição computacional de miRNA de Drosophila 1. Identificar regiões conservadas Sem sobreposição e cruzamento Prefere clean matches à repeated matches Tamanhos maiores que a metade do maior match Score baseado no tamanho e nos vizinhos

AVID – Alinhamento Global Predição computacional de miRNA de Drosophila 1. Identificar regiões conservadas AVID – Alinhamento Global D. Melanogaster 1287 contigs D. Pseudoobscura 18000 contigs Eliminar os genes anotados, tais como: exons, transpossons, snRNA, snoRNA, tRNA, rRNA Alinhamento total resultou em 51.3 de 90.2 MB de sequências intrônicas e intergênicas

Determinar uma região candidata a miRNA Predição computacional de miRNA de Drosophila 1. Identificar regiões conservadas Determinar uma região candidata a miRNA Janela de 100 unidades (pares de nucleotídeos alinhados ou gap) avança no alinhamento critério mínimo de conservação:  13% gaps e  15% mismatchs critério satisfeifo -> sequência Dm/Dp guardada em arquivo multi-fasta -> janela avança 10 unidades 436.000 regiões conservadas em sequências intrônicas e intergênica 118.000 super-regiões (agrupamento de regiões que apresetaram sobreposição de 10 nt)

Predição computacional de miRNA de Drosophila 2 Predição computacional de miRNA de Drosophila 2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops

Predição computacional de miRNA de Drosophila 2 Predição computacional de miRNA de Drosophila 2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops Análise de regiões conservadas com o algoritmo de dobramento de RNA (folding), mfold 3.1 miRNA pode estar localizado em qualquer uma das fitas (forward e reverse), o pode interferir na qualidade do hairpin predito 436.000x2 = 872.000 mfolds cutoff -> mínimo de 23 pares de bases e energia livre de um braço G  -23.0 kcal/mol

Métricas para o helical score: Predição computacional de miRNA de Drosophila 2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops Métricas para o helical score: Premia nucleotídeos pareados em +1 Penaliza cada loop simétricos de um nucleotídeo em –1 Penaliza cada loop simétrico de dois nucleotídeos em –2 Penaliza progressivamente loops simétricos com mais de três nucleotídeos, assim como bulbos e loops assimétricos Maximiza o tamanho de stem e minimiza o loop Um score total foi calculado pela fórmula: (helical score +(ABS(G)/2))/2

Predição computacional de miRNA de Drosophila 2 Predição computacional de miRNA de Drosophila 2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops D. Melanogaster (Dm) regiões com maior score de cada super-região melhores 25.000 super-regiões Dm miRNA candidato -> regiões pareadas com maior score dentro de cada super-região score médio de regiões pareadas Dm/Dp score total dos melhores 3 hits, rankeados com o score médio Dm/Dp WU-BLAST de seq. Dm contra seq. de Anopheles D. Pseudoobscura (Dp) 21/24 membros do conjunto referência Dm, foram agrupados com os melhores 600 candidatos a miRNA

Predição computacional de miRNA de Drosophila 3 Predição computacional de miRNA de Drosophila 3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados

Predição computacional de miRNA de Drosophila 3 Predição computacional de miRNA de Drosophila 3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados Aplicação de Filtros booleanos – Remoção de regiões com alto score e/ou alta conservação que não são candidatas à miRNA. Trimagem da ponta fora do braço principal Blocos conservados de pelo menos 22 nt Estes blocos devem estar localizados a aproximadamente 10 nucleotídeos do loop final Remoção das classes 4, 5 e 6 ~ 1/3 dos stem-loops conservados passaram pelos filtros 18/24 (75%) sequências (conjunto referência) estavam entre os primeiros 124 candidatos

Predição computacional de miRNA de Drosophila 3 Predição computacional de miRNA de Drosophila 3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados

Predição computacional de miRNA de Drosophila 3 Predição computacional de miRNA de Drosophila 3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados 570 passaram pelo filtro de conservação (barra verde) 124 miRseeker candidatos: conjunto referência (verde) novos miRNA (azul) miRNA conservados em uma terceira espécie (laranja)

Após o filtro booleano: 200 (18/24) Predição computacional de miRNA de Drosophila 3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados Top 600 (21/24) Após o filtro booleano: 200 (18/24) 42 novos candidatos em 200 melhores predições apresentaram conservação de sequência e estrutura em outras espécies (Anopheles e Apis)

Validação experimental dos novos candidatos à miRNA 24 novos miRNA foram validados por northern-blot de RNA total isolado de embriões, larvas/pupa e adulto de Drosophila

Conclusão miRseeker identificou com sucesso os genes de miRNA conhecidos em Drosophila 32 novos miRNA foram identificados pelo miRseeker, sendo que 24 deles foram validados por northern blot estima-se a presença de 110 genes de miRNA em Drosophila (1% dos genes codificantes, em concordância com vertebrados) divergência dentro da região loop foi inesperada. Duas conclusões: a região de loop parece ser menos crítica no pré-miRNA deve haver uma pressão de seleção na sequência que forma a região stem, já que a Dicer atua na estrutura helicoidal (braço)

Referências bibliográficas Lai et al. (2003) Computacional identification of Drosophila microRNA genes. Genome Biology, 4(7):R42 Ambros (2001) MicroRNAs: Tiny regulators with Great Potential. Cell, 107: 823-826 Pasquinelli (2002) MicroRNAs: deviants no longer. TRENDS in Genetics 18(4):171-173 Moss (2002) MicroRNAs: Hidden in the Genome. Current Biology 12:R138-R140 Mount (2001) Bioinformatics. Sequence and Genome analysis. pp. 205-235 Bray et al.(2003) AVID: A Global Alignment Program. Genoma Research 13:97-102