Sequenciamento de Genomas Marcílio C. P. de Souto DIMAp/UFRN

Sequenciamento do DNA Definição Importância Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA No caso do Projeto Genoma Homem, foi determinada a ordem exata dos 3 bilhões de pares de bases que constituem o DNA dos 24 cromossomos Importância O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece importantes informações sobre sua estrutura, função e relação evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes)

Etapas no Sequenciamento Os cromossomos, que variam em tamanho de 50 milhão a 250 milhão bases, devem primeiramente ser quebrados em partes muito mais curtas (Etapa de Subclonagem) Cada parte curta é usada como um molde para gerar um conjunto de fragmentos Cada fragmento difere no comprimento por uma única base Esta base será identificada em análises posteriores Etapas de Preparação do Molde e Reações para o Sequenciamento Os fragmentos são separados pela eletrosforese em gel (Etapa da Separação) A base final na extremidade de cada fragmento é identificada (Etapa de base-base-calling) - PHRED Este processo reconstrói a seqüência original de As, Ts, Cs, e Gs para cada parte curta gerada na primeira etapa Os sequenciadores automáticos analisam os eletrosferogramas resultantes A saída é um cromatograma de quatro-cores que mostra os picos que representam cada uma das quatro bases do DNA Depois que as bases "são lidas”, computadores estão usados para montar as seqüências curtas (em blocos de aproximadamente 500 bases cada um) em trechos longos contínuos que serão analisados para erros, regiões codificadores de genes, e outras características - PHRAP

Etapas (1/4)

Etapas (2/4)

Etapas (3/4)

Etapa (4/4)

Genomas Sequenciados Organismo Genoma Data Genes Est. H.influenzae 1.8 Mb 1995 1.740 S.cerevisiae 12.1 Mb 1996 6.034 C.elegans 97 Mb 1998 19.099 A.thaliana 100 Mb 2000 25.000 D.melanogaster 180 Mb 13.061 M.musculus 3000 Mb - Desc. H.sapiens 2003 35.000 Mais de 150 organismos tiveram seu genoma sequenciado desde 1995

Após... Derivar conhecimento significativo de seqüências de DNA definirá a pesquisa biológica através das próximas décadas - interação entre químicos, biólogos, engenheiros, cientistas da computação... A amostra a seguir lista alguns desafios na pesquisa em genética humana – aquilo que não sabemos, mesmo que tenhamos toda a seqüência do genoma humano Número de genes, localização exata e funções Regulação gênica Organização da seqüência de DNA Estrutura e organização cromossômica Tipos, quantidade, distribuição e funções do DNA não-codificante Coordenação da expressão gênica, síntese de proteínas e eventos pós-tradução Interação de proteínas em máquinas moleculares complexas Funções de genes prevista X experimentalmente determinadas Conservação evolucionaria entre organismos Proteomas nos organismos Predição de pré-disposição a doenças baseada nas variações das seqüências dos genes

Bibliografia http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/faq/seqfacts.shtml