ROMPIMENTO CELULAR   1. Introdução “Recentes” avanços nas tecnologias de DNA recombinante e de cultura de tecidos aumentaram a variedade de produtos obtidos em grande escala. Alguns produtos: interferons, antibióticos, vacinas (saúde) enzimas (aplicações comerciais) A maioria dos produtos da tecnologia do DNA recombinante são produtos INTRACELULARES, sintetizados por organismos procariotos e eucariotos. Para o isolamento e a purificação destes produtos é necessário um processo eficiente de ROMPIMENTO CELULAR

Normalmente tais processos são aplicados após a separação e a lavagem das células, para eliminar resíduos de meio de cultura.   Para células que possuem apenas MEMBRANA celular, como células animais e hibridomas, o rompimento é facilmente conseguido com baixa força de cisalhamento, e, assim, requerem pouca energia para o rompimento. Além disso, estas células podem ser rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade.

(Na realidade, manter a integridade de tais células durante o processo já constitui um problema)   Porém, células que apresentam uma estrutura de PAREDE celular polimérica, como as células microbianas, são difíceis de se romper. Várias técnicas de rompimento foram desenvolvidas para a recuperação de proteínas intracelulares em escala de laboratório, e vários destes métodos foram então ADAPTADOS para uso em grande escala. Após o rompimento celular obtém-se um homogeneizado celular constituído por molécula alvo, biomoléculas contaminantes e fragmentos celulares.

Métodos de Rompimento Mecânicos Homogeneização a alta pressão Agitação em moinho de bolas Ultrassom (?)   Não Mecânicos Choque osmótico Congelamento/descongelamento Aquecimento Secagem Químicos Álcalis Ácidos Solventes Detergentes Enzimáticos Lise enzimática

Os mais empregados são Homogeneização a alta pressão e Agitação em moinho de bolas. Se o produto não for extremamente sensível ao calor* ou à ação mecânica**, estes são os métodos a se considerar. Atenção para os Critérios de escolha Custo da operação unitária Facilidade de aumento de escala Possibilidade de dano ao produto/perda da atividade biológica Disponibilidade e custo do agente químico (sobretudo enzima) Tipo de organismo Rendimento Necessidade de controle de temperatura 

? Disponibilidade/custo do agente químico Exemplo Facilidade de aumento de escala Bom! Métodos químicos Ruim! Possibilidade de dano ao produto ? Disponibilidade/custo do agente químico

As etapas até o término da fermentação (linha ascendente) influenciam o rompimento, ou seja, a susceptibilidade ao rompimento varia:   de um organismo para outro Ex. C. utilis é mais difícil de romper que S. cereviseae (tanto em alta pressão como em moinho de bolas) com o estado fisiológico do organismo Ex.  - células crescidas em meio complexo são mais resistentes que as crescidas em meio simples - organismos recombinantes são mais facilmente rompidos que os não recombinantes

- células crescidas em meio com limitação de nutrientes ou condições desfavoráveis apresentam a parede celular reforçada, dificultando o rompimento. As etapas da linha descendente devem levar em conta a remoção dos debris celulares, a contaminação do produto com outras proteínas e a possível desnaturação do produto. debris: fragmentos de parede celular, organelas celulares, ácidos nucléicos, etc.

2. Técnicas  Ultrassom  Um aparelho utiliza ondas sonoras de altíssima freqüência (~ 20 kHz), criando zonas de cavitação, isto é, áreas de vácuo e compressão que se revezam; quando as bolhas de colapsam são formadas as ondas de choque. Não se deve aplicar este método a suspensões muito concentradas de células (maiores que 108/mL). Cerca de 170 W, a 20 kHz são aplicados em pulsos de 30 s, ou menos, com a suspensão mantida a 4 oC em gelo. · É o método mais empregado para rompimento em laboratório

Choque osmótico   As células recolhidas são ressuspensas em solução tamponada contendo 20% (m/v) de sacarose. Após equilíbrio (~30 minutos) centrifuga-se novamente e ressuspende-se o pellet em água pura a 4 oC. Método inadequado para bactérias Gram positivas, pois as mesmas apresentam alta pressão osmótica interna. Mesmo não rompendo integralmente a célula, propicia permeabilização seletiva, permitindo a saída da molécula alvo.

Congelamento – Descongelamento   Consiste em se congelar e descongelar as células de forma repetida, em velocidade e temperaturas adequadas. A ruptura* total ou parcial da parede celular se dá pela ação dos cristais de água formados. * Possibilita a saída da molécula-alvo. Os fatores de importância a se considerar são: tipo de célula, sua idade, temperatura final de congelamento e velocidades de congelamento e aquecimento. · Método demorado e de difícil implantação em grande escala · Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas

Termólise Aquecimento da suspensão celular em banho termostatizado, com injeção direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier. Mais adequado para rompimentos em larga escala, devido à sua simplicidade. Amplamente empregado para o rompimento de algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à produção de proteína microbiana. Kluyveromyces fragilis inulinase 50 oC 12-14 horas Escherichia coli enzima 90 oC 15 min.

Lise enzimática  As enzimas são capazes de hidrolisar paredes celulares de células microbianas. Quando uma certa quantidade de parede é removida, a pressão osmótica interna rompe a membrana citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado para o meio externo. As paredes celulares de leveduras possuem duas camadas principias, sendo uma camada externa do complexo proteina-manana e uma interna, de glucana. O sistema enzimático para o seu rompimento é composto, portanto, de diferentes enzimas como glucanases, proteases e mananases.

Bactérias Gram negativas e Gram positivas apresentam paredes celulares com composição diferentes, o que implica a necessidade de enzimas diferenciadas no processo. As principais enzimas bacteriolíticas são: glicosidases, acetilmuramilalanina amidases, neuroaminidase, endopeptidades e proteases.  As paredes celulares de leveduras são muito diferentes das de bactérias, e, portanto, os sistemas líticos são específicos para cada grupo particular de microrganismo. Métodos enzimáticos de rompimento de células são adequados para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento ou pressão de trabalho, geradas pelos métodos mecânicos.  

Fatores que devem ser considerados: Presença de inibidores Possibilidade de reciclo da enzima ·      Vantagens: Facilidade do controle de pH e temperatura, baixo investimento de capital, alta especificidade e possibilidade de associação com métodos mecânicos ou não mecânicos.   ·    Desvantagens: alto custo das enzimas e variação da eficiência da lise enzimática em função do estado fisiológico do microrganismo. Micrococcus lysodeikticus lisozima catalase

Rompimento químico (com álcali) Adequado quando a biomolécula-alvo é estável em pH maior que 11 Vantagens: O método é simples, de baixo custo e de fácil ampliação de escala. Desvantagem: geração de poluentes Erwinia carotovora pH 11,5 – 6,5 L-asparaginase

Homogeneização a alta pressão  Consiste da passagem forçada da suspensão celular (a alta pressão) através de um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa pressão. A queda instantânea da pressão associada ao impacto provoca o efetivo rompimento celular sem danificar proteínas.   Fatores importantes: - tamanho das células (maior => rompimento mais fácil) - pressão (maior => maior eficiência) - número de passagens (múltiplas etapas aumenta o ren-dimento)

Temperatura Fase de crescimento do microrganismo Tipo de célula Concentração celular Condições de cultivo Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:

  log Rm   =    k . N . Pa (Rm – R) (1) onde: Rm é a concentração máxima de proteina disponível para ser liberada (g/L) R é a concentração de proteina liberada (g/L) k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célula N é o número de passagens P é a pressão a é constante que depende do tipo de microrganismo e das condições de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)

E. coli (fase estacionária) 1,71 E. coli (fase exponencial) 0,64 Parâmetros típicos para a equação (1) para alguns microrganismos. Microrganismo a S. cerevisiae 2,90 E. coli (fase estacionária) 1,71 E. coli (fase exponencial) 0,64 E. coli (células contendo corpos de inclusão) 1,65 A. eutrophus 1,70 - A energia é dissipada como calor, logo o controle de temperatura é fator muito importante - Existem equipamentos (sistema tipo válvula) para escala de produção de até 4500 L/h a 70 MPa

Leveduras rompidas em homogeneizador de alta pressão

Agitação em moinho de bolas  Consiste em passar a suspensão de células por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com pérolas de vidro. Operação contínua ou descontínua. O rompimento neste caso pode ser descrito como um processo de primeira ordem:   ln (1 – R)  =  - k . t  onde: - k é uma constante que depende de parâmetros operacionais como velocidade de agitação e desenho da câmara, carga de pérolas, tamanho das pérolas e concentração celular.   - t é o tempo de batelada

Para processo contínuo, tem-se:   1 = 1 +   k . t j (1 – R) j    onde: t é o tempo médio de residência (volume total dividido pela vazão, V/Q) j é o número de câmaras em série (valor obtido experimentalmente)     Controle de temperatura é fator muito importante Cisalhamento pode inativar enzimas Existem equipamentos com câmaras de até 250 L, podendo-se operar com vazões de até 2000 L/h

Avaliação do processo Objetivo: maior rendimento possível da biomolécula-alvo em sua forma ativa Empregar método específico para dosagem Pode-se também dosar a viabilidade celular antes e depois do rompimento

ESQUEMA SIMPLIFICADO DE DIFERENTES ENVOLTÓRIOS CELULARES Bactéria Gram (+) Peptidoglicano Membrana citoplasmática Bactéria Gram ( - ) Membrana externa Peptidoglicano

Leveduras Manana com pontes de fosfodiéster   Glicano com proteina Membrana citoplasmática Fungos Alfa e beta-glicanos Camada glicoproteica Quitina/microfibrilas  

Corpo fixo Suspensão pressão de células Anel de impacto HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÃO   Corpo fixo Suspensão pressão de células Anel de impacto

ESQUEMA DE UM HOMOGENEIZADOR A ALTA PRESSÃO