Fontes de enzimas industriais e perspectiva da enzimologia industrial Aula de enzimologia Tema Fontes de enzimas industriais e perspectiva da enzimologia industrial Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq.eel.usp.br

Sumário: A natureza das enzimas Por que usar enzimas em processos industriais? Classes de enzimas Extratos vegetais Extratos animais Enzimas microbianas 3.1 Isolamento 3.2 Metagenoma 3.3 Evolução dirigida e Engenharia de Proteínas

Quais as principais formas de se aumentar a velocidade de reações? Aumento da concentração de reagentes A velocidade de uma reação é proporcional às concentrações das espécies reagentes. Aumento da temperatura Aumenta-se a movimentação térmica das moléculas e, consequentemente, aumenta-se a fração de moléculas com energia interna suficiente para atingir o estado de transição. Uso de catalisadores Reduz-se a energia de ativação e, consequentemente, aumenta-se a fração de moléculas com energia interna suficiente para atingir o estado de transição.

O quê são enzimas? São proteínas globulares que apresentam ação catalítica (aumentam a velocidade de reações químicas). As enzimas: São sintetizadas pelas próprias células onde atuam; Apresentam elevada especificidade de ação; Podem ser expressas em maior ou menor quantidade, de acordo com as condições fisiológicas; Apresentam atividade modulável, permitindo um ajuste fino do metabolismo às necessidades celulares.

Natureza das enzimas As enzimas, como todos os catalisadores, são compostos capazes de aumentar a velocidade de reações químicas, sem alterar a proporção entre reagentes e produtos encontrada no final da reação e sem serem efetivamente consumidos durante o processo. As enzimas aumentam a velocidade de reações químicas diminuindo a energia de ativação (quantidade de energia necessária para levar todas as moléculas de 1 mol de substância ao estado de transição). Não afetam o equilíbrio de reações.

A + B  C + D Keq relaciona-se com ∆G v relaciona-se com Eact velocidade equilíbrio K – cte Boltzman h – cte Planck v relaciona-se com Eact Keq relaciona-se com ∆G

Por que usar enzimas em processos industriais? Outros catalisadores em geral produzem: Reações inespecíficas podem resultar em baixo rendimento Altas temperaturas e/ou altas pressões, necessárias para acelerar as reações Produzem altos custos energéticos e podem requerer grandes volume de água de resfriamento Processos realizados a alta temperatura, pressão, acidez e alcalinidade necessitam de alto investimento e especialmente de equipamentos e sistemas de controle sofisticados Os subprodutos podem se difíceis de serem separados ou eliminados Impacto ambiental

Tudo isso pode ser diminuído usando enzimas Reações enzimáticas ocorrem em reações brandas de temperatura e pressão; são altamente específicas, envolvem reações rápidas e são realizadas por numerosas enzimas; Apenas pequenas quantidades de enzimas são requeridas nas reações químicas, mesmo em escala industrial, e portanto necessitam de pequeno espaço para armazenamento; Reações enzimáticas podem ser facilmente controladas e podem ser interrompidas rapidamente quando o grau de conversão de substrato é alcançado. Geram poucos resíduos – vantagem ambiental Desenvolvimento em genética e engenharia de proteínas aumentam a estabilidade, especificidade e o potencial de aplicação industrial.

Fontes de enzimas As enzimas podem ser provenientes de: • tecidos de organismos diferenciados (células vegetais e animais) papaína, extraída do latéx do mamoeiro, bromelina, obtida do talo do abacaxi ficina, obtida do látex de figueiras proteinase, do sisal amilases para a preparação de mostos de cerveja renina usada na elaboração de queijos, • microrganismos.

NOMECLATURA Classificação das enzimas em relação à reação catalisada (ENZYME COMMISSION) Classes de enzimas Numero de subclasses Tipo de reação 1. Oxidorredutases 20 Envolve o movimento de eletrons de uma molécula a outra. Em sistemas biológicos nós vemos a remoção de hidrogênio do substrato e as enzimas são chamadas desidrogenases. 2. Transferases 9 Envolve a transferência de grupos de átomos de uma molécula a outra 3. Hidrolases 12 Catalisa reações entre um substrato e a água. Moléculas grandes são quebradas em pequenas unidades. 4. Liases 7 Catalisam a adição de grupos a duplas ligações ou a formação de duplas ligações através da remoção de grupos. 5. Isomerases 6 Catalisam a transferência de grupos de uma posição a outra na mesma molécula. 6. Ligases 5 Ligam moléculas através de ligações covalentes..

O que significam os números do tipo “EC 2.7.1.1”? Utilizando-se uma classificação proposta pela Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular. Glicose + ATP Glicose-6P + ADP Enzima Nome trivial: Hexoquinase Nome Sistemático: ATP:glicose fosfotransferase (EC 2.7.1.1) 2: Transferase 7: Fosfotransferase 1: Fosfotransferase com grupo OH como aceptor 1: Fosfotransferase com grupo OH da glicose como aceptor

Enzimas usadas em processos industriais Classe Enzimas Industriais 1.Oxidorredutases Peroxidases Catalases Glucose oxidases Lacases 2.Transferases Frutosil-transferases Glucosil-transferases 3.Hidrolases Amilases Celulases Lipases Pectinases Proteases Pululanases 4.Liases Pectato liases Alfa-acetolactoase descarboxilases 5.Isomerases Glucose isomerase 6.Ligases No momento ainda não são usadas

Principais indústrias consumidoras de enzimas

Processo convencional para produção de enzimas

Perspectivas da Enzimologia Industrial Tópicos: Estratégia de busca e descoberta de enzimas Metagenoma Mutação sitio dirigida Evolução dirigida e Engenharia de Proteínas Produção de enzimas com organismos geneticamente modificados

Como selecionar um bom catalisador? Bacteria aerobia Bacteria anaerobia fungo

Potencial biotecnológico dos fungos como degradadores de materiais lignocelulósicos

Enzimas microbianas Microrganismos: 4) Pressão osmótica (NaCl): 3) O2 1) Temperatura de crescimento: Psicrófilos - crescem abaixo de 20 oC Mesófilos - 20 a 50 oC Termófilos - crescem acima de 55 oC Hipertermófilos – crescem acima de 80 oC 2) pH Acidófilos Neutrófilos Alcalófilos 4) Pressão osmótica (NaCl): Halotolerantes Halófilos Halófilos extremos 3) O2 Aeróbicos obrigatórios Anaeróbicos obrigatórios Anaeróbicos facultativos Microaerófilos Aerotolerantes

Estratégia de busca e descoberta de enzimas: O conjunto catalítico de um microrganismo selvagem pode ser avaliado através de metodologias eficientes de: 1) seleção e/ou triagem da atividade enzimática para encontrar o biocatalisador ideal para o processo de interesse. O termo seleção é utilizado para técnicas que permitem o crescimento ou vantagem de sobrevivência aos organismos que apresentam a função enzimática de interesse

Enzimas termoestáveis Enzimas de microrganismos extremófilos Enzimas termoestáveis Enzimas psicrófilas Archae: temperaturas elevadas (~ 100 oC) Alta atividade catalitica e estabilidade em baixas temperaturas Alta salinidade Maior flexibilidade – menos pontes dissulfeto e de hidrogênio pH inferior a 2 ou superior a 10 Estresse nutricional Extremozimas – Taq polimerase

O que é um bom catalisador?

Metagenoma

Descoberta de genes relacionados à degradação de biomassa em genoma do rúmen de vaca 37% foi a degradação de switchgrass no rúmen do animal em 72 h Hess et al., SCIENCE VOL 331 28 JANUARY 2011

Proteínas com alta identidade com enzimas Atividade enzimática da comunidade microbiana: Os genes foram sequenciados e comparados com sequências de proteínas com potencial atividade de celulases (CAZy) Proteínas com alta identidade com enzimas não são as mais ativas

Mutagênese sítio dirigida - desenho racional Requer conhecimento detalhado da estrutura da proteína – troca com precisão certos aminoácidos das enzimas

Mutação sítio dirigida aumentar a termoestabilidade de lacase lacase de Bacillus sp. HR03 Substituição de Glu 188 por Lys e Arg (grupos positivos) ou por Ala Nasrin Mollania, Khosro Khajeh∗, Bijan Ranjbar, Saman Hosseinkhani Enhancement of a bacterial laccase thermostability through directed mutagenesis of a surface loop Enzyme and Microbial Technology 49 (2011) 446– 452

Laccase foi expressa em E. coli, purificada (MM – 65 kDa) A - forma nativa; B - Glu-Lys C - Glu – Arg; D - Glu-Ala Uma nova ponte salina foi formada entre Arg 188 e Glu 246

Termoestabilidade

Evolução dirigida

RH + O2 + NADH + H+ --- ROH + H2O + NAD+ Exemplo de sucesso na evolução dirigida: Enzima: mono-oxigenase de Bacillus megaterium RH + O2 + NADH + H+ --- ROH + H2O + NAD+ Após dois ciclos de epPCR e 3 rodadas de StEP gerou cerca de 10.000 mutantes. Após a triagem baseada no consumo de NADH, foi identificado um clone capaz de hidroxilar alcanos de cadeia curta, como propano e butano. Esta aproximação em especial está relacionada à busca de uma enzima capaz de promover a hidroxilação de etano para gerar etanol

Produção de enzimas com organismos geneticamente modificados Atualmente: Todas as enzimas produzidas comercialmente provém de microrganismos que são um produto de programas de melhoramento genético • Técnica: Obter um fragmento de DNA que codifique a síntese de uma determinada enzima e introduzir este fragmento através de um vetor na célula hospedeira onde o código genético vai se reproduzir e se expressar.

As enzimas são produtos genéticos primários, o que torna muito atrativa sua produção por esta via. • Através dela pode-se conseguir: - Produzir enzimas de organismos superiores em sistemas microbianos; - Transferir a capacidade produtiva de uma cepa mais adequada do ponto de vista sanitário ou econômico; Melhorar o nível de produção e a pureza da enzima produzida. • Problemática: estabilidade genética do microrganismo; • Na prática: a reversão a estados sub-produtivos ou não-produtivos;

Exemplo: renina - protease de origem animal com alta demanda Substituição por renina microbiana (de Mucor miehii): parcial. Produção por tecnologia de DNA recombinante: Celltex, Genex, Genencor e Codon: produção de renina com cepas de Escherichia coli (sem excreção); Genecor: produção de renina animal extracelular com cepas Aspergillus nidulans. Outros centros: produção de renina com cepas de Saccharomyces e Kluyveromyces. Gist-Brocades: renina animal produzida por cepas clonadas de Kluyveromyces marxianus.

Produção de enzimas sintéticas Uma enzima, apesar de conter muitos aminoácidos, utiliza somente uma pequena porção destes no processo catalítico. Ex. Tripsina – 254 resíduos de aminoácidos, porém 3 aminoácidos são implicados no mecanismo de proteólise. Os demais aminoácidos – importantes para formar o sitio de união ao substrato Construir uma enzima nova ainda é inviável – não é possível predizer a estrutura tridimensional

Pontos importantes: - Utilização de enzimas mais que duplicou nos últimos anos - Acesso a patentes - Mercado de enzimas dividido em três segmentos: 1) Enzimas técnicas – destinadas à indústria têxtil e de produtos de limpeza 2) Enzimas para alimentos e bebidas 3) Enzimas para ração animal - O mercado de enzimas produzidas por tecnologia do DNA recombinante – plena expansão

Material para leitura: Purificação de Produtos Biotecnológicos , Editora Manole, Adalberto Pessoa Jr, Beatriz Kilikian (coordenadores) . cap2 – Rompimento celular Bioprospecting metagenomes: glycosyl hydrolases for converting biomass Biotechnology for biofuels Li et al, 2009; 2:10