MICROPROPAGAÇÃO E LIMPEZA CLONAL DE PLANTAS Biotecnologia

Aplicação da cultura de tecidos 1.Micropropagação 2. Limpeza clonal 3. Preservação de Germoplasma 4-Transgenia 5- Resgate de embriões 6- Fusão de protoplastos 7- Haplóides 8- Variação somaclonal 9- Produção in vitro de metabólitos

Micropropagação: Propagação de plantas em larga escala a partir de pequenos tecidos (explantes) cultivados in vitro Limpeza clonal: Obtenção de plantas livres de patógenos (vírus) a partir da cultura de tecidos (meristemas)

OBJETIVO MICROPROPAGAÇÃO Obter grande número de mudas de uma planta selecionada, em um curto período de tempo e em espaço físico reduzido

Explantes Se baseia na expressão da totipotência celular Fragmentos retirados de plantas e cultivados em um meio nutritivo, em condições assépticas, visando a obtenção de plantas completas. Se baseia na expressão da totipotência celular

FUNDAMENTOS DA MICROPROPAGAÇÃO TOTIPOTÊNCIA MORFOGÊNESE E REGENERAÇÃO ASSEPSIA HEREDITARIEDADE

Habilidade de uma célula (mesmo diferenciada) dar origem TOTIPOTENCIALIDADE Habilidade de uma célula (mesmo diferenciada) dar origem a um organismo inteiro Plantas a partir de células diferenciadas cultivadas in vitro

DIFERENCIAÇÃO CELULAR: * Processo progressivo de perda das características citológicas e fisiológicas das células embrionárias e aquisição de características de células adultas e diferenciadas * Quanto mais especializada a célula, mais difícil de expressar totipotência

Aplicações práticas e vantagens da micropropagação Multiplicação rápida de plantas de propagação vegetativa ou de difícil propagação (redução do tempo) Pode ser realizada a qualquer época do ano; Possibilidade de multiplicar grandes quantidades de plantas em uma área reduzida a baixos custos; Auxilia no melhoramento vegetal na manutenção e multiplicação de plantas híbridas (mantém a combinação genética); Extremamente importante para o estabelecimento de novas variedades onde apenas poucas plantas são inicialmente viáveis;

Aplicações prática e vantagens da micropropagação Cont. Maior controle sobre a sanidade do material propagado; Permite a obtenção de plantas livres de vírus (limpeza clonal); Criação e manutenção de bancos de germoplasma e intercâmbio de germoplasma; Uniformidade do produto final. A partir de parte da planta matriz selecionada é possível a produção de inúmeros indivíduos idênticos CLONAGEM

EXPLANTES PARA INICIAR A MICROPROPAGAÇÃO Segmento de folha Raíz Meristema/ápice caulinar

MICROPROPAGAÇÃO DE GINKO BILOBA A PARTIR DE DISCOS FOLIARES

apresentam células geneticamente estáveis Tecidos não diferenciados são preferíveis pois apresentam alta capacidade morfogenética, apresentam células geneticamente estáveis (permite regenerar plantas idênticas a planta mãe). Meristema Obtenção de plantas livres de vírus

Explantes com menor nível de diferenciação Meristema Gemas axilares Meristema apical Embriões imaturos Pendão imaturo

Meristema e ápice caulinar Explante mais utilizado para iniciar a micropropagação 1) Alta capacidade morfogenética (indiferenciado) 2) Células geneticamente estáveis, permitindo regenerar plantas idênticas a planta mãe. 3) Livre de vírus - Obtenção de plantas livres de vírus

Por que o meristema é livre de vírus? Algumas hipóteses: Falta de conexão vascular Multiplicação do vírus é menor que o crescimento apical da planta Existe um mecanismo de inativação viral nas células meristemáticas em cultura

Meristema ou ápice caulinar ? Ápices caulinares Meristema + primórdios foliares Meristema Forma de cúpula achatada Células não diferenciadas

ESTÁGIOS DA MICROPROPAGAÇÃO Segundo Murashige (1974): - Estágio I: Seleção de explantes, desinfestação e cultura em meio nutritivo sob condições assépticas.

ESTÁGIOS DA MICROPROPAGAÇÃO Estágio II: Multiplicação dos propágulos mediante sucessivas subculturas em meio próprio para multiplicação.

ESTÁGIOS DA MICROPROPAGAÇÃO Estágio III: Transferência das partes aéreas produzidas para meios de enraizamento e subseqüente Transplante para um substrato ou solo (aclimatização)

Fatores que afetam a micropropagação Material vegetal: - Genótipo - Tipo de explante (seleção e coleta) - Condições fisiológicas da planta e do explante (idade,época do ano, nutrição, condições de crescimento) - Condições fitossanitárias da planta doadora e do explante

Fatores que afetam a micropropagação Meio de cultura: - Constituição química (macronutrientes e micronutrientes inorgânicos, vitaminas,fontes de N orgânico, açucares, agente solidificante e reguladores de crescimento) - Consistência (líquido e gelatinoso) Condições ambientais: - Luz (intensidade, qualidade, fotoperíodo) - Temperatura - Trocas gasosas

Fatores que afetam a micropropagação Desinfestação dos explantes Produtos com ação Germicida Etanol Hipoclorito de sódio Hipoclorito de cálcio PPM NaDCC HgCl2 Peróxido de hidrogênio Ácidos Bases Mertiolate Fungicidas Antibióticos

Processo para obtenção de batata-semente “livre de vírus” Retirada do meristema Tubérculos selecionados Meio de cultura Multiplicação em telado Multiplicação “in vitro” Fase de crescimento

Rápida multiplicação em espaço físico reduzido Batata - 1 meristema 40 milhões de mudas/ano mudas livres de vírus aumento de produtividade de até 80% Morango - 1 meristema 100 mil mudas/ano Pelotas - 3t/ha 12 a 22t/ha Cana-de-açucar- 1 meristema 40 milhões mudas/ano 7 anos pelo processo convencional Maçã - 1 meristema 50 mil mudas/ano 10 a 15 mudas/ano processo convencional Banana - 1 meristema e repicagens + 600 mudas 4-7 brotações por repicagem

A alta capacidade de multiplicação num sistema de micropropagação se dá por: repicagens sucessivas R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 1 merit. 5 25 125 625 3.125 15.625 78.125

Cultivares de batata micropropagadas no LBV/UPF Mudas indexadas Macaca  Ciclamen  Lady Rosetta  Rosaura  Elvira  Hertha  Ágata  Achat  Ágria  Synfonia  Baraka Mudas indexadas LBV/UPF

SISTEMAS DE MICROPROPAGAÇÃO 1) Multiplicação por meio da proliferação de gemas axilares Tufos de parte aérea são formados, estes são divididos em partes menores, ou cada parte é isoladas das demais para formação de novos explantes.

SISTEMAS DE MICROPROPAGAÇÃO 2) Multiplicação mediante indução de gemas adventícias Originadas em locais diferentes daqueles onde se formam no curso normal de desenvolvimento da planta. Ocorre de forma direta e indireta por organogênese

SISTEMAS DE MICROPROPAGAÇÃO 3) Multiplicação via embriogênese somática. a) b) c) Indução de calos embriogênicos e regeneração de plantas de milho Grando, 2001

LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL DA UPF Plântulas de batata micropropagadas Mudas de batata aclimatizadas em estufa Tubérculos de batata-semente pré-básica

Municípios beneficiados:  Ibiraiaras (RS) Bom Jesus (RS) Santa Maria (RS) Santa Maria do Herval (RS) Canguçu (RS) Passo Fundo (RS) Canoinhas (SC) Mafra (SC)

LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL DA UPF Plântulas de morangueiro micropropagadas Aclimatização de mudas matrizes de morangueiro em estufa Planta de morangueiro proveniente do cultivo in vitro

LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL DA UPF Plântulas de gipsofila micropropagadas Aclimatização de mudas de gipsofila Flores de gipsofila

LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL DA UPF Plântulas de orquídea oriundas da semeadura in vitro Orquídeas do orquidário da UPF

Micropropagação de Alcachofra in vitro LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL DA UPF Micropropagação de Alcachofra in vitro

Micropropagação de Ginkgo biloba in vitro LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL DA UPF Micropropagação de Ginkgo biloba in vitro

Resultados de pesquisa: Micropropagação Ginkgo biloba Doutorando Nilton Mantovani

RESULTADOS – Fase de isolamento - A caseína hidrolisada (500 mgL-1) estimulou o desenvolvimento das gemas axilares em 27,8% dos segmentos nodais 39

RESULTADOS - Fase de isolamento - A caseína hidrolisada induziu a formação de múltiplos brotos em 80% dos segmentos nodais KIN e carvão ativado- sem efeito no desenvolvimento das brotações na fase de isolamento 40

Exemplos ornamentais Begônia Lili Rose Violeta Samambaia Limonium        Exemplos ornamentais Begônia Lili Rose Violeta Samambaia Limonium Spathiphyllum Antúrio

Exemplos olerícolas e frutíferas Banana Couve-flor Cenoura Abacaxi Maracujá Pêra Café

Exemplo florestais Pinus Eucalipto REFLORESTAMENTO

Três passos devem ser constantemente observados: Perpectivas Três passos devem ser constantemente observados: *Valor genético do clone a ser propagado *Ajuste da metodologia para o clone em questão * Busca de alternativas para tornar o processo mais econômico, acessível e viável embriogênese somática cultura em meio líquido robotização da operação de subcultura