Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

Apresentação em tema: "Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra"— Transcrição da apresentação:

1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Mestrado Integrado em Medicina Bioquímica II 2009/2010 2ª AULA PRÁTICA Doseamento da concentração plasmática de bilirrubinas Grupo IV

2 HEME Hemoglobina Mioglobina Citocromos

3 A síntese do Heme ocorre nas células do fígado e da medula óssea, sendo que o 1º e os 3 últimos passos ocorrem na mitocôndria, enquanto os intermédios ocorrem no citoplasma.

4 Glóbulos Vermelhos Formação de Bilirrubina
Hemoglobina GV têm duração média de 120 dias, ao fim dos quais são removidos e englobados pelo sistema retículo-endotelial. Glóbulos Vermelhos Cadeias de globina são desnaturadas e libertam o heme para o citoplasma. A globina é degradada nos seus aminoácidos, que são reutilizados de acordo com as necessidades fisiológicas. Destruição Formação de Bilirrubina Catabolismo do heme

5 BILIRRUBINA Produto do catabolismo do heme da hemoglobina e de outras proteínas hémicas, como os citocromos CO é o único de fonte endógena, o ferro é reciclado

6 Catabolismo do Heme

7 É pouco solúvel em meios aquosos (plasma)
Apesar de ser também designada por “livre”, circula ligada à albumina

8 Liberta-se da albumina e sofre a acção da uridinadifosfato (UDP)-glucoroniltransferase
É conjugada com ácido glucurónico, formando mono (BRB-MG) e di-glucuronatos de bilirrubina (BRB-DG)

9 A BRB é hidrossolúvel e é secretada para a bílis por um transporte activo, contra o gradiente de concentração

10 Reduzida por enzimas de origem bacteriana

11 Acção de bactérias anaeróbias e posterior acção do O2

12 Juntamente com a estercobilina, perfazem os 10% que retornam ao fígado
Eliminado na urina

13 BILIRRUBINA Directa Indirecta Conjugada Livre
É lipossolúvel, com elevada afinidade para os lípidos da membrana BILIRRUBINA Directa Conjugada Reage com sais diazotados (ácido sulfanílico diazotinizado) e dá origem a azobilirrubina Reacção directa de Van der Bergh Indirecta Livre Só reage com sais diazotados (ácido sulfanílico diazotinizado) após a adição de um solvente orgânico, que quebra a ligação com a albumina Reacção indirecta de Van der Bergh

14 Icterícia

15 É consequência do aumento da bilirrubinémia
A icterícia caracteriza-se pela coloração amarelada da pele e das mucosas, devido à deposição de bilirrubina É consequência do aumento da bilirrubinémia Valores normais: < 17 μM (1 mg/dl) Hiperbilirrubinémia associada a icterícia: > 30 μM (1,5 mg/dl) Quando existe bilirrubina em excesso, esta liga-se mais fracamente à albumina e, como tal, difunde-se para os tecidos

16 HIPERBILIRRUBINÉMIA Directa Indirecta
Aumento da produção de bilirrubina Défice na eliminação hepática ou biliar Directa A bilirrubina conjugada representa mais de 50% do total Indirecta A bilirrubina não-conjugada representa pelo menos 75% do total

17 ICTERÍCIA PRÉ-HEPÁTICA
Aumento da hemólise (anemias hemolíticas) Aumento da produção de bilirrubina Reabsorção de grandes hematomas Aumento da bilirrubina não-conjugada

18 Pelo facto de a bilirrubina não-conjugada circular ligada à albumina, não ocorre o aumento da sua concentração na urina No entanto, análises à urina evidenciam níveis superiores ao normal de estercobilinogénio O excesso de bilirrubina não-conjugada pode, contudo, tornar-se bastante lesivo, já que esta é lipossolúvel e consegue atravessar a barreira hemato-encefálica, danificando o SNC O aumento dos níveis urinários de estercobilinogénio está associado ao aumento da sua produção intestinal a partir do excesso de BRB conjugada e a sua eliminação renal após reabsorção entero-hepática.

19 ICTERÍCIA INTRA-HEPÁTICA
Surge devido a alterações no metabolismo hepático da bilirrubina Défice na captação de bilirrubina pelos hepatócitos Aumento da bilirrubina não-conjugada Défice na conjugação hepática Défice na secreção de bilirrubina no canal biliar Aumento da bilirrubina conjugada

20 ICTERÍCIA PÓS-HEPÁTICA Aumento da bilirrubina conjugada
É consequência do bloqueio dos canais biliares extra-hepáticos ou do impedimento da drenagem biliar Aumento da bilirrubina conjugada Sendo esta hidrossolúvel, é eliminada a nível renal e confere uma coloração acastanhada à urina

21 Obstrução intermitente:
Obstrução total: A bilirrubina não passa para o intestino e não se forma urobilinogénio Descoloração das fezes (acolia fecal) e coloração escura da urina (colúria) Obstrução intermitente: Os níveis de urobilinogénio urinários e fecais variam Urina e fezes mais claras ou escuras consoante a produção de urobilinogénio

22 Material e Métodos

23 DOSEAMENTO DA BILIRRUBINA
Bilirrubina total Determinada na presença de dimetilsulfóxido (DMSO), por uma reacção diazo com o ácido sulfanílico diazotinado Bilirrubina directa Determinada na ausência de DMSO Os produtos das reacções originam compostos de cor avermelhada, cuja intensidade é proporcional à quantidade de BRB presente no plasma, sendo quantificáveis por espectrofotometria de luz visível. Bilirrubina indirecta Bilirrubina total – Bilirrubina directa

24 Determinação da Bilirrubina Directa
1) Doseamento, segundo a tabela: Tubos Ensaio Amostra (soro) Bilitrol Reagente 2 Solução de trabalho 1 Branco da amostra 100 μL - 1 mL 2 3 Branco do padrão 4 Padrão

25 Determinação da Bilirrubina Directa
A - Reagente 1 – (ácido sulfanílico 25 mM; HCl 74mM; DMSO 7 M) B - Reagente 2 – (ácido sulfanílico 25 mM; HCl 87mM) Reagente 3 – (nitrito de sódio 17 mM) Solução de Trabalho: Reagente 2 + Reagente 3 (20:1, v/v) Bilitrol – padrão de bilirrubina (para determinação da bilirrubina total, 58,5 mg/l e bilirrubina directa, 38 mg/l) Amostra – soro ou plasma (em EDTA, heparina, citrato; guardado no escuro)

26 Determinação da Bilirrubina Total
2) Misturar 3) Esperar 5 minutos à temperatura ambiente 4) Ler a absorvância (A) a 550 nm: Ler o tubo branco (1 e 3) contra o reagente 2 Ler tubo padrão (4) e Amostra (2) contra a solução de trabalho

27 Resultados

28 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DA BILIRRUBINA (BILIRRUBINÉMIA):
Valores normais de bilirrubina directa: Cálculo da bilirrubina directa = 0,27 mg/100 ml 0,02 mg/100 ml acima do valor normal

29 Assim a DO obtida é apenas a da bilirrubina
Nota: Calibrou-se o espectrofotómetro com o reagente 2 e com a solução de trabalho; Na fórmula para o cálculo da [brb], à DO da amostra ou do padrão, subtraímos a DO do branco da amostra ou do branco do padrão, respectivamente, para retirarmos a absorção proveniente dos outros constituintes; Assim a DO obtida é apenas a da bilirrubina

30 Discussão/Conclusão

31 Pelo que o doente não deverá apresentar hiperbilirrubinémia
A amostra analisada possuía uma ligeira elevação da BRB directa (pouco significativa): 0,27 mg/ml Pelo que o doente não deverá apresentar hiperbilirrubinémia

32 Conclusão A determinação da [BRB] plasmática e a determinação da [BRB directa] pelo Método de Van der Bergh constitui uma forma rápida de avaliar a taxa de bilirrubina bem como o tipo de hiperbilirrubinémia. Permite prever hipóteses de diagnóstico do tipo de icterícia mas não obter conclusões, apenas leques de hipóteses que serão reduzidos a um diagnóstico com o auxílio a exames complementares.