Determinado gene de interesse

Apresentação em tema: "Determinado gene de interesse"— Transcrição da apresentação:

1 Determinado gene de interesse
* Busca da sequência gênica em banco de dados→NCBI * Síntese de primers específicos para o transgene de interesse * Isolamento do cDNA do gene (vantagem) → PCR *Clonagem do cDNA do gene em um vetor . De expressão em E. coli ou Piccia, por exemplo . Binário de transformação de plantas

2 NCBI LOCUS P07371 269 aa DEFINITION:
LOCUS P aa DEFINITION: Chlorophyll a-b binding protein AB80, chloroplast precursor (LHCII type I CAB-AB80). ORGANISM: Pisum sativum ACCESSION P07371 GI:115788 swissprot: locus CB22_PEA, accession P07371

3 Sequência da Proteína do gene de interesse
>gi|115788|sp|P07371|CB22_PEA Chlorophyll a-b binding protein AB80, chloroplast precursor (LHCII type I CAB-AB80) (LHCP) MAASSSSSMALSSPTLAGKQLKLNPSSQELGAARFTMRKSATTKKVASSGSPWYGPDRVKYLGPFSGESPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFSKNRELEVIHSRWAMLGALGCVFPELLSRNGVKFGEAVWFKAGSQIFSEGGLDYLGNPSLVHAQSILAIWATQVILMGAVEGYRIAGGPLGEVVDPLYPGGSFDPLGLADDPEAFAELKVKELKNGRLAMFSMFGFFVQAIVTGKGPLENLADHLADPVNNNAWSYATNFVPGK

4 Sequência de nucleotídeos
>gi|169052: Pea cab gene, complete cds ATGGCCGCATCATCATCATCATCCATGGCTCTCTCTTCTCCAACCTTGGCTGGCAAGCAACTCAAGCTGAACCCATCAAGCCAAGAATTGGGAGCTGCAAGGTTCACCATGAGGAAGTCTGCTACCACCAAGAAAGTAGCTTCCTCTGGAAGCCCATGGTACGGACCAGACCGTGTTAAGTACTTAGGCCCATTCTCCGGTGAGTCTCCATCCTACTTGACAGGAGAGTTCCCCGGTGACTACGGTTGGGACACTGCCGGACTCTCTGCTGACCCAGAGACATTCTCCAAGAACCGTGAGCTTGAAGTCATCCACTCCAGATGGGCTATGTTGGGAGCTTTGGGATGTGTCTTCCCAGAGCTTTTGTCTCGCAACGGTGTTAAATTCGGCGAAGCTGTGTGGTTCAAGGCAGGATCTCAAATCTTTAGTGAGGGTGGACTTGATTACTTGGGCAACCCAAGCTTGGTCCATGCTCAAAGCATCCTTGCCATATGGGCCACTCAGGTTATCTTGATGGGAGCTGTCGAAGGTTACCGTATTGCCGGTGGGCCTCTCGGTGAGGTGGTTGATCCACTTTACCCAGGTGGAAGCTTTGATCCATTGGGCTTAGCTGATGATCCAGAAGCATTCGCAGAATTGAAGGTGAAGGAACTCAAGAACGGTAGATTAGCCATGTTCTCAATGTTTGGATTCTTCGTTCAAGCTATTGTAACTGGAAAGGGTCCTTTGGAGAACCTTGCTGATCATCTTGCAGACCCAGTCAACAACAATGCATGGTCATATGCCACCAACTTTGTTCCCGGAAAATAA

5 Síntese dos Primers http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
PRIMER PICKING RESULTS FOR gi|169052: Pea cab gene, complete cds No mispriming library specified Using 1-based sequence positions OLIGO start len tm gc% any 3' seq LEFT PRIMER TGGCTCTCTCTTCTCCAACC RIGHT PRIMER TTGTTGACTGGGTCTGCAAG SEQUENCE SIZE: 810 PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00 1 ATGGCCGCATCATCATCATCATCCATGGCTCTCTCTTCTCCAACCTTGGCTGGCAAGCAA >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 721 GGTCCTTTGGAGAACCTTGCTGATCATCTTGCAGACCCAGTCAACAACAATGCATGGTCA <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< 781 TATGCCACCAACTTTGTTCCCGGAAAATAA

6 Princípio da PCR: A enzima Taq polymerase é capaz de formar moléculas oligoméricas a partir de monômeros (“primers”), amplificando um determinado fragmento de DNA na direção 5’→3’ por sucessivas reações de síntese e pareamento de bases. Kerry Mullis stated: “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want”.

7 Histórico PCR 1971: Trabalho pioneiro de Gobind Khorana, que descreveu o princípio básico de replicação de um fragmento de DNA usando um jogo de primers 1983: Dr. Kerry Mullis (Cetus Corporation Emeryville, CA), juntamente com outros pesquisadores descobriram um método de iniciar e terminar a atividade da enzima DNA- polimerase em pontos específicos da fita simples de DNA Bactéria termofílica: Thermus aquaticus 1992: Cetus →Roche

8 Para 1 reação de PCR precisamos de:
DNA amostra ng MgCl mM Mix dNTPs (A, T, G ,C) M Primer sense µM Primer antisense 50 µM Tampão de reação [1 x] Taq polymerase 1 unid. H20 milliq qsp Volume final uL Um termociclador, para fazer vários ciclos (~35) de amplificação em diferentes temperaturas:

9 Reação de PCR

10 Video PCR

11 Filme Ilustrativo

12 Reação PCR Reação RT-PCR
1,0kb 1,6kb 2,0kb 500pb Produto da amplificação do DNA genômico x primers da ORF pode apresentar tamanho maior que o esperado (~ 2,0kb), indicando possível presença de íntron Reação RT-PCR 1,0kb 1,6kb 2,0kb 500pb Produto da amplificação do cDNA x primers da ORF apresenta o tamanho esperado (810 pb)

13 Splicing

14 Etapas da Clonagem Extração RNA Total (Salzman et al., 1999) primers que flanqueiam por completo a ORF do gene de interesse 28S 18S RNA mensageiro (Kits) RT-PCR (Kit)

15 Clonagem do cDNA do gene de interesse em um determinado vetor
Produto RT-PCR + Vetor Ligase Vetor Recombinante