Marcadores Moleculares: Princípios e Aplicações

Apresentação em tema: "Marcadores Moleculares: Princípios e Aplicações"— Transcrição da apresentação:

1 Marcadores Moleculares: Princípios e Aplicações
Juliano Lino Ferreira Gustavo César Sant’Ana Aluízio Borém

2 Marcadores Moleculares
Definição: É todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um segmento específico de DNA correspondente a regiões expressas ou não do genoma.

3 Polimorfismo de Izoenzimas
Fonte:

4 Polimorfismo de Izoenzimas
Limitações: expressão das enzimas influenciada pelas condições ambientais e pelo estágio de desenvolvimento. apenas sistemas enzimáticos que não apresentem variações em diferentes condições podem ser considerados como marcadores izoenzimáticos. limita o números de maçadores disponíveis e restringe o grau de polimorfismo detectado (Sefc et al.,2001).

5 RFLP Restriction Fragment Lenght Polimorphism
Fonte:

6 RFLP Alto custo Difícil execução Radioatividade

7 PCR Polymerase Chain Reaction
Kary Mullis (Prêmio Nobel em 1993)

8

9 Marcadores Baseados em PCR
Simplicidade e rapidez Pequena quantidade de DNA Não necessita de sondas (radioatividade)

10 Marcadores Baseados em PCR
RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism MICROSSATÉLITES os SSR Simple Sequence Repeat

11 RAPD Fonte:

12 RAPD Principais vantagens: rapidez, facilidade, universalidade e baixo custo. Limitação: Baixa Reprodutibilidade

13 AFLP Rhizoctonia solani Fonte:

14 AFLP Vantagens: Multilocos, alto grau de polimorfismo
Limitações: trabalhosa, alto custo

15 MICROSSATÉLITES ou SSR (Simple Sequence Repeat)
Segregação dos loci microssatélite BM152 (A) e BM181 (B) em população BAT93 x Jalo EEP558, com detecção em gel de agarose e poliacrilamida respectivamente. Fonte: Genet. Mol. Res. 6 (3): (2007)

16 MICROSSATÉLITES ou SSR (Simple Sequence Repeat)
Vantagens: altos níveis de polimorfismo, multialélicos, codominantes. Limitações: necessidade de conhecimento das sequências.

17 Inter Simple Sequence Repeat
Combina vantagens: Universalidade e simplicidade (RAPD) Alto grau de polimorfismo (AFLP) Reprodutibilidade (Microssatélites)

18 ISSR permite a detecção de polimorfismos em regiões flanqueadas por DNA microssatélite. Detecção de elevado grau de polimorfismo, alta reprodutibilidade, custo relativamente baixo e necessidade de pequenas quantidades de DNA.

19 Aplicação em diferentes áreas
Diversidade genética Filogenia Seleção assistida Mapeamento genético Evolução

20 Princípios da Técnica Amplificação por PCR do DNA, utilizando primers com 16 a 25 nt de comprimento, complementares a sítios de SSR. Permite a amplificação de segmentos do DNA situados entre duas seqüências microssatélite idênticas orientadas em direções opostas. OS primers podem ser não ancorados ou ancorados em uma das extremidades (5’ ou 3’) por uma pequena seqüência de 1 a 4 nucleotídeos.

21 Exemplo de primers ISSR
3’ ATATATATATATATATATATAT 5’ 3’ ATATATATATATATATATATCWT 5’ 3’ CWTATATATATATATATATATAT 5’ W= T, C ou G

22 Extração de DNA Amplificação Eletroforese

23 ISSR Brassica oleracea Fonte: Bornet e Branchard (2001).

24 Esquema de amplificação utilizando primer ISSR ancorado na extremidade 5’.
3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

25 Geração de ISSRs

26 Características dos ISSR
Multilocos Dominante

27 Origem da Variabilidade
1) DNA (“template”) 2) Natureza do Primer 3)Método de detecção

28 1) DNA “template” Deslizamento da DNA polimerase e falha do mecanismo de reparo ( causam variações no número de unidades repetitivas).

29 1) DNA “template” Crossing-over desigual

30 2) Natureza do Primer Ancorados na extremidade 5’ Mais polimórficos
Padrão de bandas que exige maior resolução

31 2) Natureza do Primer Ancorados na extremidade 3’ Menos polimórficos
Padrão de bandas mais bem definidos.

32 2) Natureza do Primer Não ancorados

33 3)Método de detecção Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de poliacrilamida

34 Eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídeo
Figure1 DNA fragment of rice amplified by ISSR 73 primer Figure 2 DNA fragment of barley amplified by ISSR 11 primer Fontea: Lin et al. (2005)

35 Eletroforese em gel de poliacrilamida 6% e coloração com nitrato de prata
Litopenaeus vannamei Fonte: Rodríguez (2003).

36 Principais fatores que influenciam a reação de amplificação
Temperatura de anelamento Número de ciclos de amplificação Concentração de Taq Concentração de DNTps Concentraão de primer

37 Fonte: Bornet e Branchard (2001).