Eletroforese capilar em gel

Apresentação em tema: "Eletroforese capilar em gel"— Transcrição da apresentação:

1 Eletroforese capilar em gel
Eletroforese capilar em zona Eletroforese capilar em gel Isotacoforese capilar Focalização isoelétrica capilar Cromatografia eletrocinética capilar micelar

2 separar os analitos A e B ?
Como proceder para separar os analitos A e B ? - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - B - - - - - - - - - - - - - - - - - Dados: A: 500 cargas e raio hidratado 500 UA B: 1000 cargas e raio hidratado 1000 UA Importante: neste exemplo, as cargas das moléculas não dependem do pH.

3 Li Na K Rb Raio hidratado ? H Li Na K Rb Cs Fr
Qual a ordem de migração dos íons Li+, Na+, K+, Rb+? Massa atômica: Li: 7; Na: 23; K: 39; Rb:85 600 pm Rb K Na Li H Li Na K Rb Cs Fr 500 pm 300 pm 250 pm Tempo, min Rb K Na Li

4 + - Eletroforese capilar em gel Injeção Detecção Sinal do detector
tm(1) tm(2) tm(3) tm(4) Tempo Sinal do detector

5 Eletroforese capilar em gel
Sabendo que as massas moleculares são: tm(1) = 10 minutos; MM = 500 tm(2) = 11,56 minutos; MM = 1000 tm(3) = 15,1 minutos; MM = 5000 tm(4) = 18 minutos; MM = 15000 Qual a massa molecular de um composto que apresenta tempo de migração de 13,5 minutos ?

6 Eletroforese capilar em gel
Sendo o y = log MM, e o x = tempo log MM = 0,1861 x 13,5 + 0,8505 log MM = 3,36885 MM = 103,36885 = 2338

7 varia entre um líquido viscoso e um “sólido”
Eletroforese capilar em gel varia entre um líquido viscoso e um “sólido” Gel Géis Substituíveis (Físicos) Géis Fixos (Químicos)

8 Gel químico x Gel fixo Gel Químico Gel Físico
Possui ligações cruzadas e com a parede do capilar; Estrutura de póros bem definida; O tamanho dos póros não varia após a polimerização; Partículas danificam o gel; Apresenta alta resolução dos analitos; Não substituível. Gel Físico Não apresenta ligações cruzadas ou com a parede do capilar; Redes poliméricas enoveladas; Estrutura de póros dinâmica; O tamanho dos póros pode variar; Partículas podem ser removidas facilmente; Pode ser substituído.

9 N, N’-metilenobisacrilamida
Moléculas menores DNA RNA Proteínas Gel químico Poliacrilamida [ CH ] CH2 n C O NH2 Agente crosslinking: N, N’-metilenobisacrilamida %T: concentração total de polímero %C quantidade de ligações cruzadas %T diminui o tamanho dos póros %T aumenta o tamanho dos póros

10 Gel de Poliacrilamida usualmente de 3 a 6 % de T com 5 % de C;
30 milhões de pratos/ m

11 Gel de Poliacrilamida Problemas associados aos géis fixos de poliacrilamida: Instabilidade dos géis, que podem ser “arrastados” para fora do capilar devido ao fluxo eletrosmótico Formação de bolhas durante o preparo do gel Minimização destes efeitos: Utilização de capilares revestidos, a fim de minimizar ou eliminar o fluxo eletrosmótico; As soluções de preparo do gel devem apresentar alta pureza e passarem por degaseificação. Em géis fixos a injeção deve ser eletrocinética. Por quê? Qual problema pode ocorrer quando a injeção eletrocinética é utilizada?

12 Géis físicos Agarose Moléculas maiores DNA RNA
Utilizado acima da temperatura de geleificação, por exemplo 40 C O gel de agarose é caracterizado por possuir póros grandes É o meio de escolha para a separação de moléculas de DNA de tamanho relativamente grande Apresenta baixa absortividade em 260 nm Moléculas maiores DNA RNA

13 Detecção UV/Vis; Espectroscopia de Massas;
Fluorescência: detecção indireta ou através de intercaladores fluoróforos.

14 eletroforese capilar em gel
Aplicações de eletroforese capilar em gel DNA Proteínas Polissacarídeos Polímeros sintéticos

15 DNA

16 DNA Condição desnaturante: uréia (7 a 9 mol L-1)
A ordem de migração é dada pelo número de bases Exemplo: sequenciamento de DNA Condição não desnaturante: A ordem de migração é dada pela relação carga/ área superficial Exemplo: separação de fragmentos de restrição, produtos de PCR

17 Gel de poliacrilamida de ligação cruzada, 260 nm
DNA Gel de poliacrilamida de ligação cruzada, 260 nm

18 Gel de poliacrilamida de ligação cruzada, CE-LIF
400 pares de bases 31 43 58 69 85 97 Gel de poliacrilamida de ligação cruzada, CE-LIF

19 Sequenciamento de DNA

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21 Análise Filogenética Ciência Forense Conservação de espécies Descoberta de drogas...

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24 Proteínas Antes da desnaturação ME Após a desnaturação

25 Proteínas Massa Molecular Condições de análise:capilar 32 cm; tensão
min 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30000 14400 97000 45000 66000 20100 Condições de análise:capilar 32 cm; tensão -15kV; injeção 900 mbar durante 0,1 min; detecção 210 nm; eletrólito 12% dextran, 0,4 mol L-1 Tris/Borato, pH 8,5, 0,1% SDS, (Proteínas desnaturadas segundo protocolo Pharmacia®).

26 Proteínas