Sítio de Seqüência Dirigida (Sequence-tagged sites)

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1 Sítio de Seqüência Dirigida (Sequence-tagged sites)
Sequence-Tagged Microssatélites (STMS) ou SSR ou Microssatélites Microssatélites ancorados Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Sequence-characterized amplified regions (SCARs) Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) More and more sequence information is becoming available from different sources and can be located in widely available databases. This information is extremely useful for developing new strategies for the analysis of genetic variation. A sequence-tagged site (STS) is the general term given to a marker which is defined by its primer sequences (Olsen et al., 1989). STSs have been used extensively for mapping of the human genome. Examples of STSs are given in the following slides, namely: Sequence-tagged microsatellites (STMS) also known as Simple Sequence Repeat Polymorphisms (SSRP) Anchored microsatellite oligonucleotides including inter-simple sequence repeat (ISSR) primers Sequence-characterised amplified regions (SCARs) Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) Fonte: IPGRI

2 Microssatélites (SSR)
Sequence-Tagged Microsatélites (STMS) também conhecido como microssatélite ou Simple Sequence Repeat (SSR) Normalmente locus simples e multi-alélico Co-dominante Altamente reprodutível

3 Microssatélites (SSR)
altamente informativo - vários alelos por locos detecção por PCR facilmente transferível entre labs. distribuição homogênea no genoma

4 Microssatélites (SSR)
Primer FOR NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN Repetição CA Primer REV

5 Microssatélites Bananeira 3x e 4x
Ma 1.17 Ma 1.27

6 Microssatélites Bananeira 3x e 4x Cir 24.25

7 Microssatélites Bananeira 2x Cir 24.25

8 SCARs SCARs - sequence-characterised amplified regions
proposto por Paran & Michelmore (1993) marcador locus-único derivado de fragmentos sequenciados de RAPD, ISSR, AFLP maior estabilidade - primers específicos analisado para presença/ausência possibilidade de simplificação de análise e automação

9 SCARs R S * clonar Primer específico Seqüenciar

10 SCAR - Feijoeiro ROC20460

11 SCAR - Feijoeiro SCF3

12 Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP
Combinação de RFLP e PCR Resulta em padrões muito informativos Marcador dominante

13 digestão com duas enzimas EcoRI
MseI DNA genômico digestão com duas enzimas EcoRI adaptadores MseI EcoRI ligação pré-amplificação amplificação seletiva

14 DNA digestão ligação pré- amplificação primer +1 amplificação
GAATTCCN NTTAA CTTAAGCN NAATT digestão ATTCCN NT MseI EcoRI GCN NAAT ATTCCN NT TA ligação TAA GCN N AT A pré- amplificação primer +1 ATTCCN NTTA TAAGCN NAAT C AAC amplificação primer +3 ATTCCA GTTA TAAGCT CAAT AAC

15

16 Exemplo - Gel de AFLP

17 AFLP de cana com 33P

18 AFLP de cana com 33P

19 AFLP de feijão gel desnaturante corado com prata

20 AFLP de feijão gel não desnaturante e prata

21 AFLP Primers E- ACA x M- CAA Primers E- AGC x M- CTC PBN N PBN N

22 COMPARAÇÃO ENTRE MARCADORES MOLECULARES

23 Escolha de Marcadores Característica RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS
Polimorfismo Pontual Pontual # Pontual Pontual Pontual InDel InDel Rep. InDel InDel InDel Nível de Polimorfismo médio médio alto médio médio baixo Abundância alta m.alta média m.alta média alta Dominância CoDom Dom CoDom Dom Dom CoDom [DNA] mg ng 50 ng ng ng ng Seqüência não não sim não não sim Marcação sim/não não não sim/não não não Repetibilidade alta baixa alta média baixa alta

24 Escolha de Marcadores Característica RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS
Informação/ Corrida Patenteado não sim não sim não não Investimento alto baixo alto médio baixo alto Custo médio baixo alto médio baixo médio Karp 96 US$ , , , , nd nd. Risterucci 97 FF/100 ind , , , , nd nd.