Sequenciamento usando o Método de Sanger

Apresentação em tema: "Sequenciamento usando o Método de Sanger"— Transcrição da apresentação:

1 Sequenciamento usando o Método de Sanger
Luiz Claudio Santana da Silva Maira Cicero Ferreira

2 Histórico 1975: primeira descrição do sequenciamento.
Esse procedimento foi feito usando DNA polimerase, primer, dNTP e ddNTP marcadas por 32P. Primer: se anela na região complementar do DNA simples-fita do bacteriófago dNTPs: adicionados pela DNA polimerase na região 3´após o primer. ddNTP: terminador de cadeia marcada por 32P. Era feita uma reação por base. Que depois era feito um gel de poliacrilamida e a autoradiografia pra ver as bandas e definir a sequencia de nt. Sanger, Coulson, 1975.

3 dNTPs Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.

4 ddNTPS SANGER, NICKLEN, COULSON

5 ddNTPS Atkinson mostrou a atividade inibitória do ddTTP (2´3´dideoxitimidina trifosfato). Após a incorporação do ddTTP ocorre a inibição da síntese da cadeia. Os ddNTPs marcados foi relatado por Atkinson que demonstrou que eles são terminadores de cadeia. Após a incorporação do dTTP ocorre a inibição da síntese da cadeia recém sintetizada, pois não possuem a hidroxila no carbono 3´, que permite a ligação fosfodiéster com o próximo nt. Atkinson, Deutscher, Kornberg, Russell, Moffatt. 1969 SANGER, NICKLEN, COULSON

6 Metodologia Desnaturação do DNA de dupla fita.
Primers: iniciam a reação feita pela DNA polimerase, nesse momento será definido qual a cadeia que será usada como molde. Denaturação do DNA de dupla fita., para que a enzima polimerase seja capaz de fazer a polimerização da fita-filha Sanger, Coulson, 1975.

7 Metodologia Usam-se baixas concentrações de ddNTPs e altas concentrações de dNTPs. Em cada reação, um ddNTP é incorporado aleatoriamente ao invés do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização. Sanger, Coulson, 1975.

8 ddNTP marcada por 32P Feitas 4 reações: uma para cada base ddNTP marcada por 32P. Formados diversos fragmentos com tamanhos variados, de acordo com a posição e o ddNTP incorporado. Sanger, Coulson, 1975.

9 ddNTP marcada por 32P Feito gel desnaturante de poliacrilamida.
A autoradiografia é feita após a corrida do gel. A mobilidade do fragmento do gel é diretamente proporcional ao seu tamanho, portanto os fragmentos serão separados de acordo com o número de nt presentes. Sanger, Coulson, 1975.

10 Leitura Após autoradiografia a ordem dos nucleotídeos, pode ser visualizada. Porém, esta será complementar ao molde. Sanger, Coulson, 1975.

11 Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.

12 Sanger, Coulson, 1975.

13 Sequenciadores automáticos
Criado em 1986 pela Applied Biosystems. O princípio é o mesmo do sequenciamento manual feito por Sanger. ddNTPs são marcados por fluorescência característica, permitindo a distinção das cadeias truncada pela respectiva fluorescência. Cada ddNTP utiliza um fluorocromo diferente, portanto as reações podem ser feitas em um mesmo tubo.

14 Sequenciadores automáticos
Feita a eletroinjeção onde as moléculas de DNA(-) em suspensão são introduzidas nos capilares. Cada fragmento, recebe um feixe de laser de argônio, que será detectado por um sistema óptico e uma câmara de CCD. DNA tem carga negativa, portanto é atraído para o cátodo do sequenciador

15 Sequenciadores automáticos
A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde.

16 Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.

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20 Formato de saída – AB1

21 Formato de saída- AB1

22 Formato de saída – AB1

23 Formato de saída – PHD

24 Formato de saída – SEQ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTCTTATATANNATTCCCGCCTTCNNTAAAGTATGCAAATAATGTCTGGTTTTAAAGTAATGATTAACTGCATGCTCAGGATAATAGGGTTTGATGCCTTTATCCATGGGAAAATATTTGGTAACCTTAGGATAAAATCTAGCTGGCATAACCAATTTTAATCTTCGTAATTCATTTTTAGTAAGTGGGCCTACAAATTGTTCACATTTAGAAATCAGGTCTTGATGCAAATGAATATTAGGAAAAGAAGNANTGNACCAGTTAGGATTAAAAGCAGGCACAGTAGAAGAGTAAAGCCCCGTAAAGTTTCCCACCTTATGAGTCCAAGGAATACTAACATTGGNAAGCTGGAGATTGAGATCTGCGGCGACGCGGTGATTGAGATCTTCGTCTGCGAGGNGAGNNAGTTCTTCTNCTAGGGGACCTGCCTCGTCGNCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTGNATAGGATAGGGGCNTTTGGTGGTCTGTANGCAGGANGAGTGCGAATCNNCACTCNNAAGGACACCAAATACTCTAGNACTGTNCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGANNNNACANCAGNNGTCTANNTTNNNNNNNNNNNNNNNNAACNTAGNNAACTACTAAANCCCTANCTNNNNCNNNNCANNNNNNNNNNCNCCCNAGNNNGCNANNNNCATNNCCTNNNNCNNNANANNNNNNANNNTNNCTNNNNNCCNTNNNGNNNNNAANNNNNNANNNNCAGNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNANNNNNNNNNNNNGGNNNANNCANNNNNN

25 Resumo do método Sanger
Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA.

26 Principal aspecto positivo
Leitura de fragmentos longos. Principal aspecto negativo Valor elevado por base sequenciada.

27 RESUMO DAS PLATAFORMAS
Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA.

28 RESUMO DAS PLATAFORMAS
Björn Nystedt, 2011

29 RESUMO DAS PLATAFORMAS
Björn Nystedt, 2011 Glenn, 2011

30 OBRIGADO (A) !