Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004

Apresentação em tema: "Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004"— Transcrição da apresentação:

1 Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004
Apresentação: Gilka e Gustavo

2 Distrofia Muscular Tipo I (DM1):
Doença autossômica dominante ligada a expansão de repetições CTG na região 3’ não traduzida do gene DMPK (DM protein kinase) Indivíduos normais: 5 a 37 repetições Indivíduos afetados: 50 a 5000 repetições Varias hipóteses são propostas para explicar o surgimento da doença

3 Expansão de regiões repetitivas:
Nova Replicação: Célula Normal Replicação desigual do microssatélite: Célula Com Expansão Formação do grampo

4 Por que a expansão de CTG leva à distrofia miotônica?

5 Perguntas sobre o possível efeito da expansão:
Local da expansão x Transcrito funcional Cinase DM Só a cinase que sofre e ela teria efeito pleiotrópico? A expansão do gene tornaria a cromatina instável?

6 Hipótese dos autores: RNA do gene mutante (expandido) se liga aos fatores básicos de transcrição (TFs), sequestrando-os dos locais de onde eles deveriam atuar.

7 Se mRNA mutante seqüestra alguns TFs seletivamente, deve haver um acúmulo dos TFs ligados ao mRNA mutante e não a outros mRNAs.

8 Experimento 1 Para testar a premissa anterior foi realizada uma imunoprecipitação de extratos nucleares com anticorpos contra: NUP153 (proteína do complexo de poro) CUG-BP1 (controle – alta afinidade pelo mutante) PDGRF-â (proteína da membrana) Sp1 (fator de transcrição) Soro Seguida de RT-PCR do precipitado para verificar em qual destas proteínas o RNA mutante estava ligado e se outros RNAs estavam ligados a elas

9 Fatores de transcrição (TFs) ligam-se seletivamente ao RNA mutante em células DM1:
Para Sp1 Para RARã Alelo selvagem Alelo mutante

10 mRNA mutante seqüestra os TFs
A depleção leva a uma redistribuição dos TFs dentro da célula afetada? mRNA mutante seqüestra os TFs CROMATINA RPN

11 Experimento 2: Extração do núcleo e separação dos componentes:
Miócito Extração do núcleo e separação dos componentes: DNase I : isola fração da cromatina RNase : isola fração do RNP Analise de western blot dos TFs (RARã, Sp1 e Sp3, STAT1 e STAT3) por 4,5 semanas para RARã e 3 semanas para os demais. Extrai o núcleo WESTERN BLOT DNaseI Cromatina RNase RNP

12 Dinâmica da distribuição dos fatores de transcrição nos compartimentos nucleares em células normais e em células DM1 Western blot de RARã: Células normais Células DM1

13 Redistribuição dos TFs (RARã, Sp e STAT) em células afetadas (DM1):
Redistribuição dos TFs das famílias Sp e STAT após 3 semanas (por Western blot): Razão de RARã na cromatina/RNP em quatro linhagens após 4,5 semanas em cel. Normais e DM1: Crom. RNP Crom RNP Para RARγ: Resultado não convincente Repetir o procedimento com número fixo de células

14 Distribuição de RARã na cromatina durante o cultivo para um número fixo de células:

15 A retirada dos TFs dos seus locais específicos de atuação diminuiria a expressão dos genes dependentes desses fatores?

16 Experimento 3: Para medir os níveis de mRNAs dos genes escolhidos, realizou-se uma RT-PCR quatitativa, chamada análise de TaqMan: (“Com quantos ciclos a reação chega a tantos mols de replicons?...”). Além disso foi feita um Northern Blot de células antes da indução e depois da indução da expressão de DMPK

17 Northern Blot de mRNAs de genes específicos antes e depois da indução do gene DMPK:

18 Níveis relativos de mRNAs em células normais e DM1:

19 A expressão dos genes que codificam os TFs também é diminuída, levando a uma maior diminuição da expressão dos genes dependentes desses fatores. Levando a: x Baixa na transcrição de TFs Baixa na transcrição dos genes dependentes dos TFs mRNA TF

20 E a doença? O gene CLCN1 codifica CIC-1,que é um canal de cloro dos músculos esquéleticos,no qual sua alteração implica em uma Distrofia miotônica do tipo 1. Em células afetadas os níveis de mRNA deste gene é diminuído, devido provavelmente à diminuição de Sp1.

21 Será que é? Quando se restabelece o nível de Sp1 na célula afetada (via transdução), o nível de expressão de CLCN1 também é restabelecido?

22 Experimento 4: Foi feita uma transdução através de um plasmídio com alta expressão de Sp1 e Sp3 a fim de “reabastecer” a célula de Sp1para verificar se os níveis de expressão de CLCN1 aumentariam também.

23 Níveis de mRNA dos genes CLCN1 e FCGRT após expressão de TFs da família Sp:

24 Conclusões: Os resultados dos experimentos corroboram com a hipótese dos autores de explicação da relação entre a expansão de DMPK e o surgimento da distrofia miotônica do tipo I