Lee, CA,Huang, CTF, King A, Chan PJ.

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1 Lee, CA,Huang, CTF, King A, Chan PJ.
Differential effects of Human Papillomavirus DNA Types on p53 Tumor-Supressor Gene Apopitosis in sperm Lee, CA,Huang, CTF, King A, Chan PJ. Gynecologic Oncology 85, 511–516 (2002) Equipe: Cybelle Cristina Maria Angélica

2 Papilomavirus Estrutura: DNA dupla fita circular
8 ORFs (E e L), 1 região de controle (LCR) Capsídeo icosaédrico Patogênese: Infectam células basais do epitélio Causam lesões hiperplásicas benignas que podem evoluir para o câncer HPVs de alto e baixo risco Infecções latentes no epitélio e outros tecidos

3 Presença do HPV no sêmen:
Alterações na motilidade do espermatozóide (astenospermia) Diminuição da capacidade reprodutiva Fragmentação do DNA e apoptose em espermatozóides p53: Proteína nuclear que se liga ao DNA e regula a expressão de pts envolvidas no controle do ciclo celular Possui três domínios: ligante ao DNA, oligomerização e ativação da transcrição

4 Gene localiza-se no cromossomo 17
Encontra-se freqüentemente mutado durante infecção por HPV HPV E6 + Ubiquitina-ligase + p p53 Objetivo Determinar a integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 de espermatozóide durante a exposição a diferentes tipos de HPV.

5 Materiais e Métodos Preparação da amostra Amostras de espermatozóide foram coletadas de doadores HPV negativos e lavadas; Fragmentos de DNA de HPV dos tipos 6b/11 (157 pb), 16 (98 pb), 18 (83 pb), 31 (162 pb) e 33 (103 pb) e um fragmento controle HLA-DQA1 (242 pb) foram colocados em tubos e incubados juntos com as amostras por 24h. Um tubo sem fragmentos de DNA também foi incubado (controle não tratado) Os fragmentos de DNA do HPV contém os genes E6 e E7 A integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 foi avalida através dos ensaios DNA disc chip

6 Ensaio DNA Disc Chip Descongelamento Ressuspenção Aquecimento p/
HPV e DQA Primers antisense Amplificação do DNA Exons 5 e 8 p53 Amostra não tratada Primers sense Descongelamento Ressuspenção Aquecimento p/ Desnaturação do DNA DNA fitas simples derivado amostras expostas ao DNA de HPV e DQA Corante Syr Gold Marcação do DNA com corantes fluorescente DNA fitas simples derivado amostras não tratadas Bisbemizide

7 Ensaio DNA Disc Chip DNA fita simples DQA
Discos de membrana confeccionados DNA fita simples controle DNA fita simples HPV Os discos foram analisados em um microscópio de epifluorescência Imagens capturadas por uma câmera e gravadas em um computador Imagens coladas para o programa Paint, convertidas em escala de cinza e analisadas Discos alinhados em um vidro Formação do Chip

8 RESULTADOS *A análise do gene P53 em esperma mostrou significante fragmentação apopitótica no exon 5 exposto ao DNA do HPV tipo 18 acarretando uma queda na fluorescência exibida pelo exon;

9 *Em contraste, a exposição do DNA ao HPV tipo 16 resulta em fragmentação do DNA do exon 8 mas não do exón 5; *O HPV dos tipos 31 e 33 não exibem fragmentação significante; *O DNA intacto DQA1 exibe máxima fluorescência em contraste com o DNA danificado que devido a pouca hibridação exibe pouca fluorescência;

10 *A motilidade do espermatozóide foi reduzida na presença de fragmentos de DNA das regiões E6 e E7em todos os tipos de HPV testados; *A motilidade também foi reduzida na presença de fragmentos do controle positivo;

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12 DISCUSSÃO * Neste estudo, fragmentos de DNA preferencialmente das regiões E6 e E7 dos genes de oncoproteínas de transformação foram utilizados para avaliar o efeito direto na instabilidade da P53em esperma; *A nível genômico, o efeito direto da integração do HPV no genoma do hospedeiro causando instabilidade no gene P53 não foi claramente demonstrado, embora seja sugerida uma relação de causa e efeito; *Embora em muitos casos o gene P53 tenha sido danificado, os dados sugerem que os danos dependem do tipo de vírus pois estes tem alvo específico representado por importantes exons;

13 *Os HPVs tipos 31 e 33 não afetam significativamente os exóns da P53;
CONCLUSÃO *Em suma, o presente estudo demonstrou que fragmentos das regiões E6 e E7 do DNA de HPV tipos 16 e 18 alteram a expressão dos exóns 5 e 8 do gene da P53; *Os HPVs tipos 31 e 33 não afetam significativamente os exóns da P53; *A motilidade e progressão foram reduzidas em espermas expostos a fragmentos do DNA de HPV sugerindo a diminuição da capacidade de fertilização e possibilidade de transmissão de genes modificados pelos vírus durante a fertilização.