Terapia genética no controlo da dor crónica

Apresentação em tema: "Terapia genética no controlo da dor crónica"— Transcrição da apresentação:

1 Terapia genética no controlo da dor crónica
Serviço de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Terapia genética no controlo da dor crónica Francisca Santos Nilza Pinto Orientadoras Dra. Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares Maio 2005 Porto

2 «An unpleasant sensory and emotional experience which we primarily associate with tissue damage or describe in terms of tissue damage, or both» (IASP)

3 Sistema endógeno de controlo da dor

4 Um dos tratamentos mais utilizados no alívio da dor crónica são opiáceos como a morfina e compostos similares. efeitos colaterais habituação

5 Terapia genética tratamento alternativo

6 Tecnologia cujo objectivo é corrigir a expressão de genes alvo implicados no desenvolvimento de doenças: - Sobre-expressar esse gene alvo - Ou diminuir a sua expressão Através do uso de vectores que transportam o gene terapêutico até às células-alvo.

7 Tipos de vectores: víricos e não víricos
Os mais utilizados são os víricos Penetram naturalmente nas células Os vectores víricos são derivados de vírus por substituição da componente patogénica por genes terapêuticos.

8 Terapia genética da dor
Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal Fink et al., apresentado ao NIH Pohl et al., 2003

9 Terapia genética da dor
Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal Fink et al., apresentado ao NIH

10 Bolbo raquidiano ventrolateral antinociceptivo
Outros alvos: Regiões do encéfalo que controlam a transmissão da dor na medula a partir de determinadas estruturas do bolbo raquidiano Bolbo raquidiano ventrolateral antinociceptivo VLM

11 Injecção do HSV-1 (Herpes Simplex Virus -1)
VLM activar os neurónios antinociceptivos do VLM

12 Construção do vector ICP4 hCMV-P PA lacZ TK UL US
Delecção do gene ICP4 Não replicativo Inserção da cassete (promotor de citomegalovírus e transgene) no gene da timidine kinase Transgene lacZ: beta galactosidase detectada por imunocitoquímica

13 Com base em estudos prévios:
- O HSV-1 tem grande afinidade pelos neurónios e migra retrogradamente do terminal axonal até ao corpo celular - Os estudos de marcação retrógrada com traçadores neuroanatómicos mostraram que os corpos celulares dos neurónios aferentes ao VLM ocorriam no encéfalo e na medula espinhal Mas, com o HSV-1 só se observaram corpos celulares que exprimiam a beta-galactosidase em alguns núcleos do encéfalo. Não foram detectados corpos celulares na medula espinhal SELECTIVIDADE DE MIGRAÇÃO?

14 Tentou-se encontrar o genoma vírico na medula espinhal por PCR
Objectivo do trabalho Detectar o DNA do vector para concluir sobre a sua migração Tentou-se encontrar o genoma vírico na medula espinhal por PCR

15 Metodologia Injecção estereotáxica do vector no VLM
Sacrifício por decapitação (10 dias após injecção) Dissecção: 1) Bolbo raquidiano (imunocitoquímica) 2) Medulas (DNA) Medulas: Bolbos: Extracção de DNA Cortes de congelação PCR Imunocitoquímica Electroforese

16 Injecção estereotáxica do vector

17 - Com a suspensão vírica n=4
- Com soro fisiológico n=1

18 Dissecção do bolbo e medula
Decapitação 10 dias após injecção Dissecção Rato C+ e C-: bolbo congelado a – 80ºC Restantes: bolbo fixador (paraformaldeído 4% - 4h-sacarose 30%) medula espinhal (alargamentos cervical e torácico) congeladas a -80ºC

19 Reacção imunocitoquímica de detecção da beta-galactosidase
Objectivo: verificar local de injecção Metodologia A) Cortes finos (40µm) no micrótomo de congelação dos bolbos fixados B) Reacção imunocitoquímica

20 Anticorpo secundário Anticorpo primário Beta-galactosidase

21 Extracção de DNA -Digestão com proteinase K
Objectivo : Extracção de DNA para posterior amplificação por PCR Material Bolbos dos C+ e C- Medulas dos animais com injecção no VLM Metodologia -Digestão com proteinase K - Precipitação das proteínas - Precipitação do DNA com isopropanol - Ressuspensão do DNA em 20µl de água bi-destilada - Quantificação do DNA pela leitura da densidade óptica a 260nm

22 PCR Princípio da técnica : O PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction) permite seleccionar e amplificar sequências específicas de uma cadeia de DNA graças à utilização de oligonucleotídeos : “primers” Vários protocolos Primers para amplificar o transgene lacZ da construção vírica 95ºC- 45 sec 60ºC- 30 sec 72ºC -45 sec 30 ciclos Primers para amplificar o gene da timidina kinase do HSV-1 Optimizar o protocolo

23 Electroforese Gel de agarose a 2%
Visualização das bandas de DNA depois à adição de brometo de etídio

24 - Reacção imunocitoquímica : local de injecção
Resultados - Reacção imunocitoquímica : local de injecção Os ratos cujo local de injecção estava no VLM foram utilizados para amplificação do DNA vírico na medula

25 Amplificação do gene lacZ no alargamento torácico da medula espinhal
Branco Controlo- Controlo+ Rato1 Rato2 Rato3 200pb ICP4 TK UL US hCMV-P PA lacZ L R

26 Amplificação do gene da TK nos segmentos torácicos da medula espinhal
hCMV-P PA lacZ TK L R 60ºC 62ºC A B A B Optimização do protocolo DNA do controlo+ Temperatura de annealing a 60 e 62ºC Concentração de MgCl2 (cofactor da Taq Polimerase) a A:2,5mM e B:4mM Betaina optimiza condições de PCR estabilizando o DNA Condições escolhidas Temperatura de annealing 60ºC -2,5mM de MgCl2 95ºC-45sec 60ºC-30sec 72ºC-45sec 30 ciclos 300pb

27 Mesma quantidade de DNA total por amostra:5000ng/microg
Amplificação do gene da TK nos segmentos cervicais e torácicos da medula espinhal Alargamento cervical 300pb Branco Controlo- Controlo+ Rato1 Rato2 Rato3 Mesma quantidade de DNA total por amostra:5000ng/microg Diferenças de quantidade de DNA vírico no alargamento cervical e torácico Alargamento torácico

28 Perspectivas futuras:
1- Questão técnica: quantificação de DNA por real time PCR ou DNA standard 2- Alargar o estudo a áreas encefálicas para aprofundar a selectividade da expressão beta-galactosidase 3- Esclarecer os mecanismos que impedem a detecção da beta-galactosidase

29 Bibliografia Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated gene transfer for the treatment of cronic pain. Experimental Neurology Jun; 184(2003)S25-S29 Pohl M, Meunier A, Hamon M, Braz J. Gene Therapy of Cronic Pain. Current Gene Therapy Mar; 3(3):223-38 Wilson SP, Yeomans DC, Bender MA, Lu Y, Goins WF, Glorioso JC.Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephalin-enconding herpes virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Mar; 96(1999) Wilson SP,Yeomans DC. Genetic Therapy for Pain Management. Current Review of Pain. 2000; 4: Lopes JMC. Fisiopatologia da Dor. Biblioteca da Dor. Permanyer Portugal

30 Agradecimentos Dr.ª Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares pela orientação facultada ao longo da realização do nosso trabalho; Laboratório de Biologia Celular e Molecular e Instituto de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado; Dr.ª Sandra Rebelo pela amizade; E, ainda, a todos os nossos amigos!

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