Controle - e descontrole - do Ciclo Celular

Apresentação em tema: "Controle - e descontrole - do Ciclo Celular"— Transcrição da apresentação:

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2 Controle - e descontrole - do Ciclo Celular
As três vertentes: 1. Os fãs do Pink Floyd, que acreditavam que a chave estava nas vias disparadas pelos 10% de soro fetal 2. Os caçadores de galinhas, que procuravam por oncogenes inseridos em retrovírus tumoral 3. Os enfurnados nos laboratórios estudando levedura e rãs, que não têm cancer, e descobriram o relógio

3 Vertente 1, das células 3T3 Meio de cultura
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) sais, aminoácidos, vitaminas, glicose tampão bicarbonato/ác. carbônico pH 7 em 5% CO2 (ou sal de fruta ENNO, caixa Tupperware e esponja) Soro fetal bovino 10% v/v, seria o que uma célula “veria” Cultilab (Campinas) SORO x PLASMA: o que corre nos vasos? PDGF: importante fator plaquetário do soro

4 Só vou repicar umas células...
Lavar 2x com PBS Adicionar 1 mL de tripsina em PBS EDTA Deixar filme de tripsina Ressuspender em meio com soro o soro inativa a tripsina subcultivar com diluição (1/4, 1/6...) Anotar o número da passagem no frasco (número não é ilimitado!)

5 Fibroblastos: modelo de estudo
Célula normal = inibição por contato cresce até a “confluência” ou “monocamada” pára de se dividir com conteúdo de DNA = G1 motivo: p27 bloqueia quinases reguladoras das etapas do ciclo, exceto a da mitose células ficam quiescentes (Go) Célula tumoral: perde inibição por contato empilha = focos de transformação ensaio: nº de placas com foco (+TPA ou PMA)

6 Descobrindo quanto se vai viver
Pedaço de tecido embrião ou braço + pinça + tesoura colonização da superfície da placa = cultura primária (geralmente fibroblastos) crise: cerca de 100 passagens se o doador for jovem e morte da cultura por senescência protocolos iniciais: quase sempre resultavam em células transformadas (empilhavam) protocolo 3T3 ou 10T1/2: imortais normais (repiques feitos sem adimitir confluência)

7 Fases do ciclo de divisão celular
Dois eventos visíveis M= células redondas e bi-refringentes S = incorporação de Timidina tritiada ou BrdU Dois vãos ou “gaps” G1, antes de S (DNA = 2C) G2, depois de S (DNA = 4C) Detecção de proliferação FACS, incorporação de BrdU ou índice mitótico Células quiescentes = estado “G zero” (Go)

8 Duração do ciclo Variações de G1 Determinação do tempo de dobramento
G1 é ausente em embriões (não em mamíferos) até a midi-blástula Variável, porque soma-se a paradas intermitentes em Go Determinação do tempo de dobramento curva de crescimento

9 Sincronização das células
Todas na mesma fase do ciclo Mitotic Shake-off (destacamento mitótico) Nocodazole 50 ng/ml por 4 horas (<100% em M) BANG, BANG, BANG Carenciamento para soro (24 h) – ponto R células mais jovens que meio G1 páram (G1pm) células mais velhas que meio G1 ciclam (G1ps) ao final das 24 h, todas se acumulam em Go demoram o dobro de G1 para percorrer Go/G1 Afidicolina (inibe Pol. alfa): bloqueio em fase S

10 Vertente 2, oncogenes: v-sis fator de crescimento
BPV E5 dimeriza receptor v-Erb-B receptor ativo EJ-ras transdução subversiva v-src cinase de tirosina HPV E6 liga anti-oncogene HPV E7 liga anti-oncogene SV40 Large T liga 2 anti-oncogenes v-fos fator de transcrição v-jun fator de transcrição c-myc fator de transcrição Oncogenes de vírus humanos = + complexos

11 Lesões em DNA = gatilho Quebras em cadeias de DNA
sedimentação em gradiente de sacarose desnaturação alcalina suave (Bihrimboin) eluição alcalina Quantificação de modificações químicas Inibição de síntese de DNA taxa de incorporação de timidina tritiada Lesão = causa de mutação

12 Sobrevivência celular
Letalidade é um evento raro Segue distribuição de Poisson Classe Zero de Poisson quando a média de eventos letais é de 1 por célula 37% das células sobrevivem Ombro da curva de sobrevivência indica capacidade de suportar lesões por reparo ou pouca genotoxicidade

13 Muitas lesões? Pode ser disparada a apoptose
morte celular programada diferente de necrose iniciada por proteólise limitada mediada por caspases envolve ação de nucleases que atacam o DNA Bloqueios de ciclo celular evitam apoptose permitem tempo de reparo mecanismos de checagem ou “checkpoints”

14 Instabilidade genômica
Câncer = pelo menos 4 mutações incompatível com ocorrência ao acaso necessário instabilidade genômica Mutações reguladores do próprio ciclo celular positivos = protoncogenes (vírus RNA animal) negativos = supressores de tumor (vírus DNA) Afetam o relógio do ciclo celular quinases dependentes de ciclinas

15 Vertente 3, relógio e checkpoints
Controle balanceado Rb, E2F p21 ou p27 Checkpoint p53, degradação programada (ciclina D, cdc25) Bloqueio x apoptose