Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz

Apresentação em tema: "Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz"— Transcrição da apresentação:

1 Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz
Leishmania Type Culture Collection (WDCM) Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose (Departamento de Imunologia/IOC) Centro de referência (WHO International Leishmania Reference Strain Center e SVS/MS) Acervo (representando espécies e variantes genéticos de Leishmania do Novo Mundo): 2.500 estoques criopreservados em diversos intervalos de tempo desde 1980. FIOCRUZ

2 Equipe Curadores - Elisa Cupolillo (PhD) e Gabriel Grimaldi (PhD)
Luiz Eduardo de Carvalho Paes – Tecnologista, BSc Ângela Cristina Volpini – Tecnologista, PhD Lilia Macedo Firoozmand – Tecnologista, BSc Adriana Gaspar – Apoio Técnico FIOCRUZ

3 Serviços prestados: Consultorias Formação de pessoal
Depósito (guarda) de amostras Fornecimento, gratuito, de cepas de referência de Leishmania para grupos de pesquisas do Brasil e do exterior Tipagem bioquímica e molecular de amostras e isolados FIOCRUZ

4 Perfil da coleção de Leishmania do IOC
Trabalhos em colaboração com vários pesquisadores na América Latina Depósito de cepas de outros laboratórios, onde eram mantidas em cultura ou criobancos Isolados originais enviados diretamente ao nosso laboratório para identificação e que são depositados. Nos últimos 5 anos, foram coletados mais de isolados, provenientes de diversas áreas endêmicas no Brasil e outros países da América do Sul. FIOCRUZ

5 Catalogação de dados relevantes da coleção
Entrada das amostras Cada estoque depositado no Banco recebe um número de identificação (IOC/L), sendo informatizados os dados relevantes sobre o estoque. Os estoques são reconhecidos pelo seu código (WHO 1990), que indica (1) espécie do animal reservatório ou vetor, de onde o parasito foi isolado; (2) país e (3) ano de isolamento; e (4) designação da cepa original Ex.: MHOM/BR/1980/LSP MCHO/CR/1987/356 IFLA/BR/1967/P32 Tipagem Bioquímica e Molecular e Classificação Taxonômica Todas as amostras são classificadas em zimodemas empregando 18 sistemas loci-enzimáticos – IOC/Z Perfis de RFLP dos ITSrDNA estão sendo construídos e adicionados ao banco FIOCRUZ

6 Protozoário unicelular Flagelado Heteroxeno Dimórfico
Leishmania Protozoário unicelular Flagelado Heteroxeno Dimórfico Leishmania é um protozoário flagelado, heteroxeno, pertencente à família Trypanossomatidae. dimórfico, Apresenta-se de duas formas principais: uma flagelada, denominada promastigota, que é encontrada no tubo digestivo do seu hospedeiro invertebrado, os flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) ou em culturas axênicas e (ii) a forma aparentemente sem flagelo, denominada amastigota, que é encontrada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados ou em culturas de células do sistema fagocítico mononuclear. A Leishmania é o agente etiológico da Leishmaniose, podendo ser ela cutânea, mucosa, difusa, disseminada ou visceral. O Flebotomíneo é o vetor, que com o repasto sanguíneo é capaz de transmitir a doença, inoculando na derme do hospedeiro promastigostas que se alojam nas células do sistema fagocítico mononuclear, principalmente nos macrófagos, transformando-se em amastigotas e passando a se multiplicar dentro do organismo do hospedeiro. FIGURA 1. Amastigotas FIGURA 2. Promastigotas

7 CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE Leishmania NO NOVO MUNDO
Adaptado WHO 1990 e Cupolillo et al. 1994

8 COLEÇÃO DE Leishmania DO IOC
Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose/ IOC Centro de referência em Leishmania (WDCM 731) Estoques congelados: (a) Leishmania na forma promastigota (b) A maior parte dos estoques está criopreservados com glicerol 8% - Informatização dos dados e cadastro dos estoques Atualmente existem mais de 2000 amostras na Coleção de Leishmania do IOC , e uma coleção de Leishmania significa no geral, a preservação e manutenção de um grande acervo de parasitas, provenientes de diversas áreas endêmicas e em diferentes anos de isolamento, capaz de representar a biodiversidade de espécies descritas neste gênero. A principal importância de uma coleção se baseia em servir como fonte de matéria para futuras pesquisas. A (LTCC) é cadastrada na World Federation for Culture Collection– WFCC -(WDCM 731), Anos atrás, a classificação dos parasitas causadores das leishmanioses em humanos era baseada somente nas características extrínsecas (características clínico-epidemiológicas e no comportamento dos parasitos cultivados em laboratório), porém, hoje se sabe que os fatores intrínsecos do parasito são os marcadores mais estáveis e eficientes para a caracterização das espécies, pois não são modificados ou mascarados pelo hospedeiro ou fatores ambientais (Grimaldi et al., 1987). os métodos mais utilizados para identificar e caracterizar os isolados de Leishmania são: a eletroforese de enzimas - análise de zimodemas (Gardener et al., 1973; Kreutzer et al., 1987;) e o uso de anticorpos monoclonais - análise de serodemas (Grimaldi et al., 1987). Sendo que de desde Lab de Pesq em Leishm funciona como um centro de referência em Tipagem de Leishmania Todas amostras da coleção devem ser catalogadas na sua entrada, recebendo um código (no qual denominamos IOC/L), ficando vinculados a cada amostra diversos dados clínicos e epidemiológicos como local de isolamento, hospedeiro, forma clínica, entre outros.

9 1)Avaliar a estabilidade molecular (identidade) dos parasitos recuperados nas culturas empregando técnicas bioquímicas e moleculares; 2) Estabelecer um padrão ideal do número e forma morfológica dos parasitos a serem novamente criopreservados a fim de garantir amostras viáveis em um futuro descongelamento; 3) Determinar a viabilidade dos parasitos correlacionando com o tempo e condições que se mantiveram criopreservadas; 4) Garantir uma re-criopreservação com sucesso para que mais tarde as amostras ao serem descongeladas se apresentem estáveis e viáveis, isso através do conhecimento de uma faixa ideal do número de parasitas no momento da criopreservação;

10 Métodos empregados nos estudos taxonômicos
Isoenzimas 6-fosfogluconato desidrogenase Nucleosídio Hidrolase Aconitato Hidratase Fumarase Glicose-Fosfo-Isomerase Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase Hexoquinase Isocitrato desidrogenase Malato desidrogenase Enzima Málica Manose-Fosfato-Isomerase Nucleotidase Peptidase Fosfo-Gluco-Mutase Fosfatase Ácida 6PGDH - NH - ACON - FUM - GPI - G6PDH - HK - IDH - MDH - ME - MPI - PEPD - PGM - ACP - Dezoito sistemas enzimáticos foram definidos para a identificação de espécies e variantes de Leishmania, principalmente entre aquelas que circulam no Novo Mundo e a partir daí foram estabelecidos perfis definidores de diferentes zimodemas, utilizados como referência na identificação de todos os estoques analisados neste projeto (Cupolillo et al., 1994). Além de MLEE, outros métodos moleculares têm sido aplicados em estudos de taxonomia de Leishmania. Destacamos aqui o uso de marcadores como PCR-RFLP ITSrDNA e o RAPD, que estão sendo empregados neste estudo.

11 Caracterização por MLEE – várias espécies de Leishmania
Destacar os resultados Amostras de Leishmania que não mantiveram a mesma caracterização descrita nos registros da Coleção de Leishmania do IOC.  Sete amostras foram classificadas no zimodema 27 e, logo, identificadas como L. (V.) braziliensis. . IOC/L 1731 confirmou ser uma variante enzimática de L. (V.) braziliensis, designada como IOC/Z53, seguindo os registros da Coleção. . IOC/L 390 foi classificada dentro do zimodema 20 descrito para híbridos entre L. (V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis. . Duas amostras classificadas como L. (L.) major confirmaram sua caracterização, porém foram agrupadas em um novo zimodema, não sendo idênticas a cepa de referência. Algumas amostras não confirmaram a mesma caracterização descrita nos registros da Coleção de Leishmania. O estoque IOC/L 28 apresentou um perfil típico de L. (V.) braziliensis, mas havia sido descrito como sendo L. (L.) chagasi; os estoques de IOC/L 540 e IOC/L 541 foram depositados como L. (V.) braziliensis, mas neste estudo apresentaram um perfil de L. (L.) amazonensis.

12 PCR ITSrDNA Os primers usados: ITS 1(5’ GCTGTAGGTGAACCTGCAGCAGCTGGATCATT-3’) e
ITS 2 (5’-GCGGGTAGTCCTGCCAAACACTCAGGTCTG-3’) Organização estrutural do lócus rRNA. SSU S LSU(1) IR IR2 NTS ITS Os ITS rDNA representam as regiões não codificadas dos rRNA conhecidas como os espaçadores internos transcritos que são pequenas seqüências de nucleotídeos (1 a 1.2Kb em Leishmania) de grande variabilidade, intercaladas pela subunidade 5.8 e limitadas por segmentos altamente conservados (FIGURA 3). Oligonucleotídeos desenhados para esta região permitem a amplificação dos ITS por PCR e a posterior digestão com enzimas de restrição geram perfis de RFLP úteis para detectar possíveis variações entre isolados de uma mesma espécie, determinando assim o grau de variabilidade genética da população (Cupolillo et al., 1995) (FIGURA 4). RFLP PCR - Produto específico de ITS rDNA

13 Classificação e relação filogenética
enriettii Leptomonas L.(S.) gymnodactyli L. (S.) tarentolae hoogstraali L. (L.) amazonensis mexicana donovani tropica L. (L.) major L.hertigi colombiensis equatoriensis L. (V.) braziliensis L. (V.) sp guyanensis panamensis 0.1 100 57 96 70 98 82 94 PARALEISHMANIA L. (Viannia) L. (Sauroleishmania) L. (Leishmania) FIOCRUZ

14 viabilidade relacionada ao tempo
explicar Viabilidade celular de L (L.) chagasi em relação ao tempo de criopreservação.

15 viabilidade relacionada a solução de congelamento
GLICEROL explicar Relação entre o crioprotetor utilizado para a preservação de Leishmania

16 Procedimentos operacionais usados na manutenção e controle de qualidade dos espécimes colecionados:
Normas padronizadas - “World Federation for Culture Collections” (WFCC), “American Type Culture Collection” (ATCC), Organização Mundial da Saúde (OMS) Manutenção – passagens seriadas Preservação – Nitrogênio líquido Controle de qualidade: tipagem períodica por métodos bioquímicos e moleculares FIOCRUZ