Universidade Federal do Triângulo Mineiro Curso de Graduação em Biomedicina Indução de resistência ao benzonidazol em isolados humanos de Trypanosoma cruzi.

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1 Universidade Federal do Triângulo Mineiro Curso de Graduação em Biomedicina
Indução de resistência ao benzonidazol em isolados humanos de Trypanosoma cruzi Aluno: Rodrigo Nunes Cal Orientador: Prof. Dr. André Luiz Pedrosa Co-orientadora: Profa. Dra. Eliane Lages-Silva

2 Introdução A doença de Chagas humana:
- É uma das doenças tropicais mais comuns na América Latina, sua incidência só não é maior que a da febre amarela e da esquistossomose. - Prevalência do sul EUA até a Patagônia. - Estimativa de infectados: 18 milhões. - População em risco: 100 milhões. - Brasil: área endêmica (1/4 do território); 6 milhões de infectados; 25 milhões de pessoas expostas ao risco de infecção. - Causa cerca de mortes anualmente no continente americano. Agente causador: Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi genes XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

3 T. cruzi e doença de Chagas
Reservatórios: homem, mamíferos domésticos e silvestres. Modo de transmissão: picada do "barbeiro", transfusão sanguínea, via congênita e oral, acidentes de laboratório e transplante. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

4 XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
Tratamento Drogas utilizadas no tratamento: benzonidazol, nifurtimox, fármacos antifúngicos da classe dos azóis (cetoconazol, itraconazol, econazol e miconazol). Os fármacos disponíveis atualmente para o controle da doença, apresentam baixa eficiência e/ou fortes efeitos colaterais. Nifurtimox Benzonidazol XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

5 Resistência/suscetibilidade a drogas em T. cruzi
FILARDI & BRENER (1987): caracterização de cepas do parasito que são naturalmente resistentes ou sensíveis ao tratamento com benzonidazol e nifurtimox. MURTA et al. (1998): a resistência natural do T. cruzi ao benzonidazol e ao nifurtimox pode explicar a baixa taxa de cura de pacientes chagásicos. MURTA et al. (2006): identificação de genes que são diferencialmente expressos nas cepas resistentes e suscetíveis das populações de T. cruzi. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

6 XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
Justificativa A doença de Chagas é, segundo a Organização Mundial de Saúde, uma doença negligenciada: -ausência de medicamentos totalmente eficazes contra a doença. -falta de investimento em novos alvos terapêuticos. A descrição de cepas do T. cruzi que adquirem resistência após o tratamento do paciente com benzonidazol pode torná-lo sem utilidade em um futuro próximo. O estudo de cepas de T. cruzi resistentes ao tratamento com benzonidazol pode esclarecer os mecanismos de ação de várias drogas tripanossomicidas. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

7 XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
Objetivos -Selecionar cepas de T. cruzi antes e após o tratamento com benzonidazol. -Comparar o crescimento do parasito em meio LIT e LIT-Mod na presença e ausência de benzonidazol. -Estudar alterações nos perfis biológico e genético das cepas selecionadas. -Determinar um perfil de resistência/suscetibilidade a droga em T. cruzi. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

8 XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
Materiais e métodos Isolamento e manutenção das cepas de T.cruzi : Cepas isoladas antes do tratamento dos pacientes: 1230 e 1206. Cepas isoladas após o tratamento dos pacientes: 3314 e 3306. Os parasitos foram inicialmente cultivados em meio LIT (Liver Infusion Tryptose). Curvas de crescimento : O crescimento in vitro das cepas de T. cruzi foi avaliado pelo inóculo de 2,0 x 106 formas epimastigotas nos meios LIT e LIT modificado (substituição do soro bovino por 3% de urina humana) na presença e ausência de diferentes concentrações de soro de cão tratado com 1000 mg/kg de benzonidazol. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

9 XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
Materiais e métodos Protocolo para indução de resistência ao benzonidazol : As cepas 3314 e 3306 foram inoculadas em meio LIT contendo diferentes concentrações de soro de cão tratado com benzonidazol (1%, 2%, 3%, 4% e 5%). Os parasitos sobreviventes da cepa 3314 foram novamente inoculados em meio contendo a droga (0,2%, 0,5%, 1% e 2%). Eletroforese em campo pulsátil : Os cromossomos de T. cruzi foram separados de acordo com o seu tamanho por eletroforese em campo pulsátil (PFGE) e os perfis de separação foram determinados após coloração das bandas cromossômicas com brometo de etídio. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

10 Crescimento in vitro das cepas de T. cruzi em meio LIT e LIT-Mod
Resultados Crescimento in vitro das cepas de T. cruzi em meio LIT e LIT-Mod 103 104 105 106 107 108 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dias Parasitos/mL Meio LIT Meio LIT-Mod cepa 1230 () cepa 1206 () Pré-tratamento Pós-tratamento cepa 3306 () cepa 3314 () XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

11 Avaliação da suscetibilidade das cepas de T. cruzi ao benzonidazol
Resultados Avaliação da suscetibilidade das cepas de T. cruzi ao benzonidazol 103 104 105 106 107 108 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dias Parasitos/mL Cepa 1230 103 104 105 106 107 108 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dias Parasitos/mL Cepa 3314 Símbolos: meio LIT () LIT+ 5% BZ () LIT-Mod () LIT-Mod+ 5% BZ () XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

12 Avaliação da suscetibilidade das cepas de T. cruzi ao benzonidazol
Resultados Avaliação da suscetibilidade das cepas de T. cruzi ao benzonidazol 103 104 105 106 107 108 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dias Parasitos/mL Cepa 1206 103 104 105 106 107 108 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dias Parasitos/mL Cepa 3306 Símbolos meio LIT () LIT+ 5% BZ () LIT-Mod () LIT-Mod+ 5% BZ () XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

13 Indução de resistência in vitro ao benzonidazol em T. cruzi
Resultados Indução de resistência in vitro ao benzonidazol em T. cruzi 103 104 105 106 107 108 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dias Parasitos/mL Cepa 3306 Cepa 3314 Símbolos: meio LIT () LIT+1% de BZ () LIT+2% de BZ () LIT+3% de BZ () LIT+4% de BZ () LIT+5% de BZ ( | ) XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

14 Indução de resistência in vitro ao benzonidazol em T. cruzi
Resultados Indução de resistência in vitro ao benzonidazol em T. cruzi 104 105 106 107 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Dias Parasitos/mL Cepa 3314 Símbolos: meio LIT () LIT+0,2% de BZ () LIT+0,5% de BZ () LIT+1% de BZ () LIT+2% de BZ ( | ) XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

15 Caracterização genética por PFGE
Resultados Caracterização genética por PFGE cepa 1206 cepa 3306 cepa 3314 Análise por eletroforese em campo pulsátil de cepas de T. cruzi cultivadas em meio LIT normal. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

16 XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
Discussão Cepas 1206 e 1230  maior crescimento em meio LIT e LIT-Mod: - Tratamento alterou as características de crescimento das cepas Indução de resistência ao BZ nas cepas 3306 e 3314: - protocolos relacionados à indução de resistência aos fármacos da classe dos azóis, nifurtimox e benzonidazol (NOZAKI et al., 1996; BUCKNER et al., 1998). Não houve diferenças cariotípicas das cepas estudadas antes e após o tratamento dos pacientes com benzonidazol: -Alterações no cariótipo foram relatadas em T. cruzi durante a seleção a resistência à droga (NOZAKI et al., 1996). XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina

17 XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
Conclusões O meio LIT-Mod pode substituir o meio LIT para o cultivo in vitro de T. cruzi. O tratamento do paciente com benzonidazol alterou as características de crescimento do parasito. Não houve diferenças no cariótipo molecular entre as cepas isoladas de um mesmo paciente. A resistência ao benzonidazol parece ter surgido de eventos moleculares intrínsicos e não pela seleção de subpopulações resistentes do parasito. XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina