Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa.

Apresentação em tema: "Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa."— Transcrição da apresentação:

1 Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa Orientador: Gonçalo A. G. Pereira Co-orientador: Anderson F. da Cunha

2 Resumo Combustíveis renováveis – produção etanol Processo fermentativo Saccharomyces cerevisiae Processo de floculação Aumento da produção de etanol Projeto domesticação de linhagens industriais

3 Produção Etanol

4 Esquema Fermentação/Respiração

5 Produção etanol

6 Floculação

7

8 Construção pYADE4-FLO5

9 Expressão do gene FLO5 sob controle do promotor gene ADH2 e produtividade de etanol

10 Características gene FLO10 Não apresenta regiões repetitivas como o FLO1/FLO5 Floculação menos intensa Gene naturalmente reprimido por glicose

11 Regulação do gene FLO10 utilizando o promotor do gene ADH2

12 Experimentos de Northern

13 Construção cassete integrativo

14 Integração no genoma de Saccharomyces

15 Produtividade Etanol Gene Pet191 Responsável montagem citocromo C Deleção do gene – aumento produtividade etanol Oliver & Hunter (1998) – 43%

16 Dispupção gene PET191 PCR do plasmídeo pfa6aKanMX4 - primers que tenham seqüência do PET191 genômico e primers que amplifiquem o gene KAN do plasmídeo

17 Caracterização da linhagem industrial, análise da expressão gênica diferencial durante o processo fermentativo industrial e domesticação de Saccharomyces cerevisiae (Pedra 2). Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Juan Lucas Argueso (Ducke University) Luis Humberto Gomes (Esalq) André Ricardo Alcarde (Esalq) Anderson Ferreira da Cunha Silvia Kazue Missawa Osmar Netto Felipe Galzerani Fabiana Melo Duarte Marcelo Carazzolle

18 Linhagem utilizada: Pedra 2 (JAY270) Esporos: JAY289, JAY290, JAY291, JAY292 Linhagem heterotálica Caracterização por pulse field array genômico Teste produção de etanol Seqüênciamento

19 Produtividade etanol

20 Seqüênciamento Solexa Foram 4 etapas de seqüênciamento Total readsCobertura* JAY29111.967.34231x JAY2925.373.88114x Total17.341.22345x *A cobertura foi calculada considerando que o genoma de Pedra 2 tem (12Mb)

21 Montagem genoma Todos os clusters Clusters acima de 100bp Clusters acima de 200bp Clusters acima de 300bp Clusters acima de 500bp #clusters (contigs e singlets) 10.854.46720.54412.75110.1817.147 Total bp421.078.83712.039.43111.012.02110.382.2429.202.996 Montagem realizada com o programa Vcake Distribuição de tamanho dos contigs

22 Análises Comparativas (regiões em comum)

23 Análises comparativas (regiões específicas de Pedra 2) 100bp200bp300bp500bp e-value#clustersTotal bp#clustersTotal bp#clustersTotal bp#clustersTotal bp e -100 83381.245.173796266.028244137.5747174.547 e -50 2846417.318226111.97711185.1856568.260 e -30 941186.77315791.6169576.8996164.082

24 Blastx/NR das regiões específicas de Pedra 2 200bp300bp500bp e-value#clustersTotal bp#clustersTotal bp#clustersTotal bp e -50 9357.3485448.0463638.663

25 Lista de novos genes Gene # Contigs (E-value) Descrição Desconhecido - ORF YKL2153 (0.0 / 1e-97 / 3e-75)Gene localizado no cromossomo XI. Proteína localizada no citoplasma. TNA12 (0.0 / 3e-71)Responsável pela captação de baixos níveis de ácido nicotínico. THI12 (3e-85 / 2e-09)Catalisa a primeira etapa comum da síntese de isoleucina e valina e é marca para várias classes de inibidores. Localizado na mitocôndria. MPR12 (9e-85 / 4e-45)Envolvido na resistência do análogo L-prolina. Não encontrado na linhagem S288C. Desconhecido - ORF YOL1601 (1e-06)Gene localizado no cromossomo XV. Proteína desconhecida. KNQ13 (2e-35 / 2e-34 / 6e-09) 2 (7e-95 / 1e-09) 1 (1e-48) Gene encontrado na levedura Kluyveromyces lactis. Relacionado com detoxicação do citoplasma e resposta ao stress redox. Não encontrado, mas similar a ATR1 em S288C FLR12 (2e-142 / 5e-44)Relacionado ao transporte de drogas pela membrana plasmática. Desconhecido1 (8e-06)Função desconhecida, similar a a-D-glucosidase; transcripcionalmente ativado por genes envolvidos no efeito pleiotrópico de resistência a drogas. Desconhecido2 (7e-39 / 8e-32) 1 (5e-08) 1 (3e-45) Desconhecida ADH62 (7e-55 / 1e-30)Relacionado com a síntese de álcool ou resistência a aldeído. Desconhecido - ORF YFR0541 (4e-12)Desconhecida HXT81 (3e-12)Função desconhecida, com similaridade a família de transportadores de hexose. Expressão é induzida por baixos níveis de glicose e reprimida por altos níveis de glicose. Desconhecido1 (6e-74)Relacionado com transporte e metabolismo de aminoácido (arginina) AAD151 (1e-13)Suposto aril-álcool dehidrogenase. Mutantes não apresentam mudanças fisiológicas. Desconhecido – ORF YOL1591 (9e-17)Proteína solúvel de função desconhecida. Mutantes são viáveis. MEL11 (0.0)Precursor de a-galactosidase, que converte melibiose em glicose e galactose. LAC12 (1e-62 / 6e-38)Envolvido na síntese de ceramida, funcionalmente equivalente a LAG1. MUC11 (1e-35)Glicoproteína de membrana relacionada com floculação, formação de biofilmes. FLO51 (7e-42)Envolvido com floculação. COS21 (7e-44)Desconhecida Desconhecido1 (1e-139)Desconhecida Desconhecido1 (1e-10)Envolvida na síntese de precursor de tiamina.

26 Montagem de genes de Pedra 2

27 Análise da expressão gênica diferencial em Saccharomyces cerevisiae (linhagem Pedra 2) durante o processo fermentativo industrial Projeto de Pesquisa de Doutorado Osmar Vaz de Carvalho Netto

28 Desenvolvimento de leveduras industriais domesticadas para o melhoramento da produção alcoólica Projeto de Pesquisa de Mestrado Felipe Galzerani

29 Análise da variação cariotípica em linhagem de Saccharomyces cerevisiae utilizada na indústria de etanol Projeto de Iniciação Científica Fabiana de Melo Duarte