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1 http://www.youtube.com/watch?v=nExcd_ wTcHg&feature=channel

2 HISTÓRIA 1860: Médico Friedrich Miescher (células do pus) Químico Felix Hoppe-Seyler-Lab. Química Fisiológica em Tübingen 1871: As nucleínas ≠ proteínas (N/C/O/H) → ? (P inorg + Proteína) 1889: Nucleínas purificadas (ácida): Richard Altman. Ácido Nucléico 1893: Kossel identificou a adenina, guanina, timina e citocina. 1894: Kossel et al. DNA (pentoses) 1909: Phoebis Levine e Walter Jacobs: organização do nucleotídeo (fosfato + pentose + base nitrogenada) 1928: Frederick Griffith. S. pneumoniae: letal em camundongos 1930: Levine: 2-deoxi-D-ribose → DNA 1944: Oswald Avery, C. M. Macleod e M. McCarty: DNA é o material genético ou as proteínas 1952: Alfred Day Hershey e Martha Chase: fago T2. Uso de radioisótopos: 32 P (DNA) e 35 S (Proteínas) e infecção de E. coli 1953: James Watson e Francis Crick: estrutura da molécula de DNA (Prêmio Nobel de Fisiologia/Medicina) http://desvendandoodna.blogspot.com/

3 Molécula DNA

4 IMPORTÂNCIA 1) Utilização de sondas, microssatélites (padrão característico → “DNA-fingerprint”) 2) Identificação de indivíduos (criminalística e testes de paternidade) 3) Localização de genes associados a doenças 4) Detecção de genes relacionados ao desenvolvimento de tumores (retinoblastoma) 5) Terapia gênica 6) Produão de vacinas 7) Modulação da expressão gênica Todas essas técnicas associadas à PCR

5 Técnica de PCR Finalidade de produzir rapidamente grande quantidade de cópias de uma determinada sequência de DNA,com o auxílio de primers específicos. Próxima aula!

6 EXTRAÇÃO DNA GENÔMICO Pontos a serem considerados 1) Tecido a ser utilizado.** Levar em consideração a quantidade de metabólitos secundários que em geral interferem com uma extração bem sucedida 2) O tecido pode ser colhido e mantido –80˚C ou liofilizado até o momento da extração 3) Todo material utilizado na extração (vidraria, soluções, pipetas, etc..), deve estar livre de DNAses. Uso de autoclavagem e forno alta temperatura (180˚C)

7 PROTOCOLOS Existem vários protocolos. Mas, recentemente surgiram os que se caracterizam pela utilização do detergente catiônico CTAB (“Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide”) no tampão de extração. Daí o nome: Método do CTAB Doyle, J.J.T e Doyle, J.L (1987)

8 VANTAGEM DO MÉTODO Caracteriza-se pela eficiência na extração a partir de amostras pequenas de tecido (30mg) ou mesmo em larga escala. Pode ser utilizado para qualquer tipo de tecido animal e vegetal, incluindo: raízes, folhas, pólen, sementes, embriões, endosperma, cultura de células em suspensão.

9 Componentes da célula

10 ETAPAS DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO 1) Maceração mecânica para romper as paredes e membranas celulares do tecido. 2) Ressuspensão do material em um tampão de extração, contendo um detergente, antioxidantes, EDTA e agente tamponante, visando a solubilização de membranas lipoprotêicas e desnaturação de proteínas, deixando o DNA protegido da ação de enzimas de degradação.

11 Auxílio da temperatura O uso de temperatura 50˚- 60˚C, na extração, durante 15- 20 minutos, facilita a solubilização e homogeneização da suspensão.

12 CIA Extração com um solvente orgânico, clorofórmio-álcool isoamílico (24V:1V). Separação da fase orgânica e aquosa por centrifugação. De forma que lipídios, proteínas e a maioria dos polissacarídeos são retidos na fase orgânica inferior, enquanto que o DNA, RNA e alguns polissacarídeos permanecem na fase aquosa superior.

13 Álcool Adicionado à fase aquosa, o álcool (isopropanol ou etanol), na presença de um sal, precipita o DNA, que pode ser isolado por centrifugação.

14 AMOSTRA DNA GENÔMICO O DNA precipitado é lavado em etanol (70%), secado à temp. ambiente e ressuspendido em um tampão Tris- EDTA (pH=7.5-8.0) acrescido de RNAse (37˚C, 30 min.) A qualidade e rendimento da amostra de DNA são avaliados por eletroforese em gel de agarose (1%)

15 GEL APÓS CORRIDA ELETROFORESE 50 ng 100 ng 1 2

16 EXTRAÇÃO DNA http://www.youtube.com/watch?v=iyb7fwduu GM&feature=fvw http://www.youtube.com/watch?v=iyb7fwduu GM&feature=fvw

17 O TAMPÃO DE EXTRAÇÃO: É COMPOSTO DE: CTAB 2% NaCl1.4M EDTA20mM Tris-HCl, pH=8.0100mM PVP1% B-Mercaptoethanol0.2- 1% (dependendo do material) Proteínase K100  g/mL (opcional) H 2 O milliQ estérilqsp (Volume Final)

18 PONTOS A SEREM CONSIDERADOS E FUNÇÃO DE CADA COMPONENTE: pH do tampão: 7.5 - 8.0. Muito importante para evitar a degradação do DNA por ataque de enzimas, como: as lipolíticas e lipoxigenases que têm pH ótimo entre 5.0 e 6.0, enquanto as DNAses nucleares, tem pH ótimo em torno de 7.0

19 CTAB O CTAB solubiliza as membranas celulares e dependendo da concentração de NaCl no tampão, esse detergente forma um complexo com o DNA e pode, portanto, ser utilizado para precipitar o DNA seletivamente. O sal, além de ser necessário para a solubilização e ação do CTAB, também é essencial para permitir a precipitação do DNA na presença de um álcool.

20 OS OUTROS COMPONENTES DO TAMPÃO Visam proteger o DNA da ação de enzimas nativas ou compostos secundários liberados com o rompimento das células.

21 EDTA O EDTA “ethylenediaminetetraacetate” é incluído para inibir enzimas dependentes de metais, principalmente DNAses. Ação quelante sobre cátions como Mg 2+ e Ca 2+

22 PVP PVP (“Polyvinylpyrrolidone”) tem um efeito antioxidante. Reduz o efeito da oxidação de compostos fenólicos como taninos, quinonas e polifenóis.

23 2-β-Mercaptoetanol O agente redutor 2-β- mercaptoetanol protege o DNA contra a atividade de enzimas tais como peroxidases e polifenolodidases, desnaturando-as.

24 AULA PRÁTICA