Colorações. Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a microtomia. A coloração visa contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos.

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1 Colorações

2 Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a microtomia. A coloração visa contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos corantes se baseia na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos mesmos com os dos tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como será descrito adiante. Objetivo da coloração

3 Corantes Ácidos e Básicos Hematoxilina e Eosina - HE: A principal técnica de coloração de tecidos para o estudo de Histologia básica é a técnica HE (Hematoxilina-Eosina). Através dessa técnica, podemos diferenciar porções basófilas e acidófilas do tecido estudado. A hematoxilina é basófila, ou seja, tem afinidade por substânicas básicas. Sendo assim, ela costuma corar o núcleo e o Retículo Endoplasmático Rugoso, locais onde há grande quantidade de proteínas (básicas pelo seu grupamento amina), em geral, cora as estruturas em azul ou roxo. A eosina é acidófila, tendo afinidade pelo citoplasma, fibras colágenas e outras substânicias ácidas das células, a eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.

4 Resumo das Etapas da coloração HE 3 passagens no Xilol (10 min cada) Álcool absoluto (1 a 2 min) Álcool absoluto (10 min) Álcool 95% (5 min) Álcool 85% (5 min) Alcool 70% (5 min) Água corrente (5 min) Hematoxilina (20 min) Água Corrente (20 min) Eosina (1 min) Álcool 85% (mergulhar) Álcool 95% (3 a 5 min) 3 passagens no Álcool Absoluto (10 min cada) 3 passagens no Xilol (5 min cada)

5 Outros exemplos de corantes: ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e orange G; básicos: azul de metileno, verde metil e azul de toluidina. Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar características estruturais, mas eles não são capazes de revelar todos componentes celulares. Outras técnicas de coloração são disponíveis para evidenciar diferentes componentes.

6 Papanicolau: para coloração de células colhidas por raspagem em cavidades naturais (vagina, mucosa bucal, etc.) e concentrados celulares a partir de derrames cavitários. Este método consiste de várias fases: - Fase de hidratação: Afim de se evitar distorções, os esfregaços que foram fixados em álcool 95% ou em álcool-éter devem ser hidratados gradualmente, passando-se através de álcoois misturados com água destilada, com gradativo aumento de água, até atingirmos a água pura, antes de serem corados pela hematoxilina. Esta fase prepara o núcleo para receber a hematoxilina que é um corante em solução aquosa.

7 - Fase de coloração do núcleo: Nesta técnica, a hematoxilina de Harris é usada regressivamente, isto é, as células são coradas em excesso e então são descoradas por uma solução aquosa para se obter a profundidade desejada para a cor do núcleo e para remover o excesso de corante do citoplasma. A água corrente neutraliza o núcleo e este se tornará azul-escuro ou roxo. O tempo na hematoxilina é de 3 a 5 minutos. É recomendável filtrar a hematoxilina antes e depois do uso. Este corante é usado para o núcleo e a membrana nuclear, que tomam coloração idêntica, enquanto que o núcleolo se cora freqüentemente em rosa, vermelho ou laranja, um pouco mais tarde.

8 - Fase de desidratação: As células devem ser desidratadas por uma conduta reversa à que antecedeu a hematoxilina afim de serem conduzidas aos corantes citoplasmáticos. O motivo desta desidratação é que tais corantes são soluções alcoólicas, enquanto que no primeiro passo houve hidratação, porque a hematoxilina é uma solução aquosa.

9 - Fase de coloração do citoplasma: Os corantes utilizados neste estágio são soluções alcoólicas que irão produzir a transparência desejada no citoplasma corado. Células que possuam o citoplasma acidófilo demonstrarão afinidade pela eosina. Aquelas que possuem o citoplasma basófilo se coram em azul pálido ou azul esverdeado, pelo verde luz que é um corante básico. Nesta última fase, todos os resquícios de água devem ser removidos através de subseqüentes lavagens em álcool 100%. Os passos seguintes no xilol, retiram o desidratante e limpam os esfregaços para a montagem permanente das lâminas com lamínulas.

10 Resumo das Etapas da Coloração Papanicolau Deixar pelo menos 10 minutos num Becker com álcool 95 % Lavar em água corrente Corar com a Hematoxilina por 3 a 5 minutos Lavar em água corrente Deixar 20 segundos num Becker com Eosina amarela. Passar por 3 ou 4 Beckers com álcool 95% Corar com o EA 36 por 5 minutos Passar por uma sequência de 5 álcoois Passar por uma sequência de 3 xilois

11 Outras Colorações Algumas substâncias intra e extracelulares promovem a redução do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras reticulares dos linfonodos, por exemplo. Gomori Grocott: impregnação pela prata detecta glicogênio e mucina. Os resultados são que, utilizando esta coloração, os fungos aparecem com limites bem precisos em negro, a mucina aparece em castanho a cinza escuro, a parte interna de hifas e micélios em rosa-escuro e a coloração de fundo em tom de verde-pálido.

12 PAS (Periodic Acid-Schiff): Para demonstrar glicogênio. Utiliza como fixador uma solução de formalina neutra, tamponada a 10% e os tecidos devem ser cortados em parafina de 5 micras. As soluções podem ser: solução de ácido clorídrico normal, solução de Feulgen e Coleman, solução de Schiff, solução de ácido periódico a 0,5%, solução de verde luz a 0,2% ou solução de verde luz.

13 Localização de lipídios: Para a localização de lipídios, são utilizados corantes que possuem alto grau de dissolução em gorduras. Os corantes, misturados com uma solução alcoólica saturada pela qual possuem baixo grau de dissociação, são colocados em contato com o tecido e então transferem-se da solução alcoólica para os lipídios. Os principais exemplos de corantes específicos para lipídios são o Sudan IV e o Sudan Negro.

14 Localização de ácidos nucléicos: A localização dos ácido nucléicos se baseia no método de Feulgen. Neste método, o DNA reage com uma solução de ácido clorídrico, que retira as bases púricas e forma grupamentos aldeídos na desoxirribose. Então, é adicionado o reativo de Schiff (fucsina básica descorada pelo anidrido sulfuroso) que se combina com os radicais aldeído para formar um composto insolúvel e vermelho. Esse método possui uma proporcionalidade entre a intensidade da coloração e o teor de DNA, de modo que zonas mais coradas possuem maior teor de DNA.

15 O RNA pode ser identificado porque possui alta afinidade com corantes básicos. Porém, como em determinados tecidos existem outras substâncias de natureza basófila, é necessário um procedimento adicional, caso se deseje localizar apenas o RNA. Devem-se preparar duas lâminas, uma contendo a enzima ribonuclease e outra sem esta enzima. Esta enzima digerirá o RNA presente na lâmina. Então, coram-se as duas lâminas com um corante basófilo. Fazendo-se a subtração das duas imagens, perceber-se-ão os locais onde previamente havia RNA.

16 Localização de polissacarídeos: A presença de polissacarídeos pode ser determinada pela técnica do PAS (Periodic Acid-Schiff). O ácido periódico oxida os grupamentos 1-2 glicol, produzindo aldeídos. Estes aldeídos reagirão com a fucsina descorada, chamada de reativo de Schiff, dando um composto de adição, violeta e insolúvel. Através dessa técnica é possível visualizar polissacarídeos simples ou associados a proteínas, sendo muito utilizada nas lâminas de fígado (acúmulos de glicogênio), estômago (camada de revestimento de mucopolissacarídeos), cartilagem hialina (glicosaminoglicanas pertencentes às proteoglicanas da matriz).

17 Fontana-Masson ("coloração da melanina"): Reage com pigmentos de melanina, bem como grânulos argentafins. A melanina corada destaca-se do restante do tecido, que adquire coloração amarelada ou alaranjada.