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T&E Analítica 2013 AMOSTRAGEM IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO ENCONTRO ABRASP 30 out 2013 T&E Analítica Flávio Leite Laboratório de Análises Químicas Rua Lauro.

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1 T&E Analítica 2013 AMOSTRAGEM IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO ENCONTRO ABRASP 30 out 2013 T&E Analítica Flávio Leite Laboratório de Análises Químicas Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP – Brasil Fone: (19) 3756 – 6600 Fax:

2 T&E Analítica 2013 BOCA/ESÔFAGO ESTÔMAGO DUODENO JEJUNO COLON TRANSVERSO COLON ASCENDENTE ÍLEO COLON DESCENDENTE INTESTINO DELGADO INTESTINO GROSSO pH= entre pH= jejum alim 4,9 5,2 6,1 5,4 6,3 5,1 6,4 Médio e Distal pH= jejum alim 4,,4 - 6,5 5,2 - 6,0 6,6 6,2 pH= jejum alim 6,5 6,8 - 7,8 6,8 - 8,0 6,8 - 8,0 7,4 7,5 pH= entre 1 - 3,5 Aproximadamente 6 metros de comprimento MEIOS SISTÊMICOS BIOLÓGICO – pHs – via oral Ref.: Michael E.AultoN 2ª EDIÇÃO DELINEAENTO DE FORMAS FARMACÊUTICAS Temperatura 37ªC

3 T&E Analítica 2013 É quando um composto sofre alteração estrutural para compostos menores ou maiores, mais estáveis em determinada condição de temperatura e pressão.: REAÇÕES DE DECOMPOSIÇÃO (Análise) Quando um composto exposto de forma natural a condições como: calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO Quando um composto é exposto de forma forçada a condições como: calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade DECOMPOSIÇÃO E DEGRADAÇÃO PRODUTOS DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO A espécie final formada, pode ser produto de várias reações. A espécie estável final está em função do conjunto de energias aplicadas.

4 T&E Analítica 2013 IMPUREZAS DA ROTA QUÍMICA OU IMPUREZAS RELATADAS Resíduos de solventes utilizados na fabricação e presença de metais/semi/ametais. Produtos de reações secundárias. Impurezas intrínsecas à matéria-prima. IMPUREZAS IMPUREZAS DE DECOMPOSIÇÃO Geradas pela instabilidade natural do compostos. Geradas, após a composição e armazenamento do produto final (contato embalagem, contato insumos, temperatura de armazenamento). Geradas nos meios sistêmicos do organismo biológico. IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO Geradas após exposição em situação de estresse. ENSAIO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA Elaborado para o estudo de NOVOS FÁRMACOS E ESTABILIDADE Pesquisa: Interferência de Potência e ou natureza genotóxicas.

5 T&E Analítica 2013 ANVISAOBJETO LOCALIZADOR ESPÉCIE DE ESTRESSSE Lim: Not-Id-Qt ICH (10-30%) INTENSIDADE ESTRESSANTE"IN VIVO" RE 899, de 29/05/2003 Validação de Métodos Item2- Especificidade e Seletividade Não defineNão traz no corpo da norma Não define IT 1 de 15/07/2008 Esclareciment o da RE 1 de 29/07/2005 Toda a IT 1temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise e Ions Metálicos Traz no corpo da IT 60°C;75%UR; HCl e NaOH 0,1N; H2O2 3% ; UV-B; Fe2 ou Cu2 0,05M Não define C P 11, de 23/01/2012 Impurezas Degradação Toda a CP 11temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise e Ions Metálicos Traz no corpo da CP Não defineArt.8 §5 Toxici e Genotoxi RDC 45 de 09/08/2012 Estabilidade de Insumos Farmacêuticos Seção VIII art temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise Não traz no corpo da norma Não define IMPUREZAS – PUBLICAÇÕES ANVISA ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Requisitos para IMPUREZAS EM NOVOS MEDICAMENTOS - várias públicações: QA/QB/QC/QD e Guide Lines

6 T&E Analítica 2013 ICH - IMPURITIES IN NEW DRUG SUBSTANCES – Q3A(R2) oct/2006 Notificação – Identificação - Qualificação

7 T&E Analítica 2013 ICH- ÁRVORE PARA IDENTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO - Q3A(R2) oct/2006 New Drugs Products - NOVOS MEDICAMENTOS É impureza com limite superior de Identificação Sem ação Estrutura Identificada? Reduzir para não mais que o limite de Identificação? Sem novas medidas Algum conhecimento de risco relevante ao ser humano? Reduzir Limite de segurança Reduzir para não mais que o limite de Qualificação? Maior que o limite de Qualificação? Considere a população de pacientes e duração de uso e considerar a realização de: a)Os estudos de genotoxicidade (mutação de ponto, aberração cromossômica) b) Estudos toxicidades gerais (uma espécie, geralmente 14 a 90 dias) c) Outros parâmetros de toxicidades específicas. (conforme o caso). Algum efeito adverso clínico relevante? Reduzir Limite de segurança Qualificado sim não sim não

8 T&E Analítica 2013 USO DE ESTRESSANTES PELA CP 11 ESTRESSAR: -Matéria prima do ATIVO que compõe o formulado -Placebo do formulado -Produto formulado ou acabado ESTRESSANTES: 1- Aquecimento 2- Umidade 3- Solução Ácida 4- Solução Básica 5- Solução Oxidante 6- Exposição Fotolítica 7- Ions metálicos DEFINIÇÃO PARA O STRESS: Degradar de 10 a 30% do ATIVO Dificuldades: -Parar a reação e manter o equilíbrio -Isolar a impureza -Quantificar/Identificar a impureza -Genotoxi (principalmente pela qdade)

9 T&E Analítica 2013 H ENERGIA DE ATIVAÇÃO Luminosidade/Ausência de Luz Resfriamento-Aquecimento Metais ou sais – Ácidos-Bases Oxigênio / Enzimas Hidratação/Desidratação Reações secundárias Radiação Ionizante e N.Ionizante Outras possíveis Caminho da reação ENERGIA DE ATIVAÇÃO Toda reação química para acontecer necessita de energia. Esta energia e denominada ENERGIA DE ATIVAÇÃO Caminho da reação Reag Prod

10 T&E Analítica 2013 REAÇÕES QUÍMICAS ESCALA MACRO São reações que ocorrem em previsão para concentrações acima de 1% em massa ou volume. H + Ácido Oleico (c/impurezas) + Metanol (c/impurezas) Oleato de Metila + Água + impurezas (a.palmítico, (etanol, (palmitado e esteárico, formol, estearato/ C4,C6, etc) a.fórmico,etc metila e etila) ESCALA MICRO São reações que ocorrem de forma secundária e nem sempre previstas dentro dos parâmetros teóricos da química reacional. Material orgânico em decomposição + cloro CH 4 + Cl 2 várias possibilidades IMPUREZA DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO Podem ocorrer na escala MACRO como na escala MICRO, sendo a escala MICRO a mais complexa para identificação e quantificação.

11 T&E Analítica 2013 REAÇÕES E MECANISMOS DAS REAÇÕES Mecanismos: - homolítico, heterolítico, pericíclico[ - nucleófilo, eletròfilo Reações: - adição, substituição, eliminação - salificação, esterificação, - oxidação branda, exaustiva e combustão - redução, polimerização Formação de Cadeias Carbônicas: - normal e ramificada - aromática - cíclica normal e ramificada - alicíclica normal e ramificada - alquil /aromática/ciclica/alicíclica Considerando as moléculas da Farmacêutica, para alterar o equilíbrio do meio a a seguinte matriz deve ser olhada para o interferente e produto: Fator 1- Concentração (quanto menor, maior deve ser Fator 2 e ou Fator 3) Fator 2-Tempo de contato Fator 3 - Energia aplicada (agitação, temperatura, radiação, etc)

12 T&E Analítica ,01 1,0 3,0 5, Intensidade estressante tempo % degradação observada 0,01 1,0 3,0 5, Intensidade estressante + temperatura tempo % degradação observada 0,01 1,0 3,0 5, Intensidade estressante tempo % degradação observada 0,01 1,0 3,0 5, Intensidade estressante + temperatura tempo % degradação observada AÇÃO DE ESTRESSANTE ÚNICO E COMBINADO - Previsão

13 T&E Analítica 2013 Considerando o Produto acrescido de Estressante 1 - Pode resultar em precipitações ou solubilizações na solução do produto, 2 - Pode ocorrer polimerizações, 3 - Pode alterar as estruturas e não aparecerem na condição analítica (principalmente nas reações com NaOH e HCl), 4 - Pode ocorrer alteração de cor, que dificultará a análise na condição analítica, 5 - Extração com solvente, pode-se supor que a impureza não seja extratível e ou ainda gerar IOV, 6 - Interações do tipo excipiente-excipiente ; ativo-excipiente ; embalagem 7- Reações conhecidas da química, como oxidação de aldeídos a alcoóis, hidrólise de ésteres, adições, quebras, etc PREVISÕES DE REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO

14 T&E Analítica 2013 IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO PARA METAIS, SEMI-METAIS E AMETAIS Em casos que a alteração do número de oxidação é de fundamental importância na aplicação. Exemplo 1: o antimônio utilizado no tratamento da úlcera de Bauru, no qual a mudança do número de oxidação do antimônio resultada em dor elevada quando ministrado na forma injetável muscular. Exemplo 2: aplicação sobre complexos metálicos, na relação: quelato / não quelato ANÁLISE DE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO POR OUTRAS TÉCNICAS Nem todas as técnicas permitem análise de impurezas de degradação Exemplo 1: Volumetria, colorimetria, potenciometria, absorção a luz ultravioleta e visível, infravermelho, etc.. Exemplo 2: Compostos que possuem sua quantificação por métodos microbiológicos, SOBRE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO Técnicas separativas: HPLC e CFG em seus detectores

15 T&E Analítica 2013 Agentes estressantes Área=1000 LB Área=700 Área= 300 Área= 650 Área= 1000 Área=1200 LC-UV/Vis GC-FID Mat.prima ou Placebo ou Formulado Sistema Físico de Separação – ALTERAÇÃO DO SINAL Submeter um produto a estressantes pode alterar o sinal analítico da espécie em análise para aquele sistema de detecção. As alterações podem resultar em diferentes interpretações. As justificativas podem ser dirigidas para fenômenos Químicos e ou Físicos. Área= 700 Não visível aquele detectpr ANÁLISE Condição Analítica : análise sem validação Método: análise com validação

16 T&E Analítica 2013 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA Placebo Prod.Acabado Prod.Acabado+Es Estressante M.Prima M.prima+Es Placebo+Es LB Para as análises no estudo de ID o cuidado com o equipamento é importante, não apenas aos danos materiais, mas às falsas interpretações de resultados.

17 T&E Analítica 2013 IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO Duas situações são colocadas para as Impurezas PRESENTES ou INDUZIDAS em um fármaco ANALISANDO COM O MÉTODO/CONDIÇÃO ANALÍTICA (CA) : Situação 1- a Cond.Analítica utilizada VISUALIZA a impureza gerada pelo estresse. Situação 2- a Cond.Analítica utilizada NÃO VISUALIZA a impureza gerada pelo estresse.

18 T&E Analítica 2013 O MÉTODO NÃO VISUALIZA : Utilizando-se deste método sobre as amostras colocadas sob os efeitos de energia (stress) poderão resultar em espécies que não sejam absorvidas pela LUZ ULTRAVIOLETA, desta forma, o sinal analítico não será percebido e não se pode deduzir que houve impureza. SITUAÇÃO – 2 – NÃO VISUALIZA Considerando técnicas separativas: CFG; HPLC, etc Absorve no UV NÃO Absorve no UV Qual direção analítica utilizar? Quantos métodos serâo necessários?

19 T&E Analítica 2013 SISTEMAS DE EXTRAÇÃO/CONCENTRAÇÃO SPME = Solid Phase Micro Extraction Sobre agulha Resina Polar; Apolar/Interm. CFG Líquido SPE = Solid Phase Extraction Mistura Líquida Adsorvente Demais Componentes -Analito fica retido -É extraído com solvente em função da polaridade Extração Líquido/Líquido Extração Líquido/Vapor) Extração Contra Corrente Extração por Ppdades Coligativas Cromatografia Preparativa Cromatografia de Camada Delgada Cromatografia de Coluna SPE - SPME - SBE

20 T&E Analítica 2013 CC e CCD (TLC) Cromatografia de Camada Delgada Cromatografia de Coluna

21 T&E Analítica 2013 HPLC PREPARATIVA

22 T&E Analítica 2013 DE FORMA BEM SIMPLIFICADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS - Determina fragmentos e Peso Molecular INFRA VERMELHO - Determina grupos funcionais RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR - Determina posições na Cadeia Carbônica ABSORÇÃO AO ULTRA-VIOLETA- Determina a presença de insaturações CC e CCD - Determinações da Química Clássica ICP (Inductively Coupled Plasma) - Determina metais/ametais/semi-metais ACOPLAMENTOS - LC/MS; LC/MSMS; GC/MS ; MIC/IV; LC/TOF; LC/PDA F-X (Fluorescência X) - Determina metais/semi-metais RAIO-X - DIFRAÇÃO - Determina Polimorfismo/Estrutura cristlina MICROSCOPIA - Determina: Polimosfismo/Tamanho de Partícula MEV/EDS - Determina análise elementar ANÁLISE ELEMENTAR (CHNSO) - Determina a composição Centesimal ABSORÇÃO AO VISÍVEL - Determina a presença de cromóforos COLORIMETRIA - Determinações da Química Clássica AED (Detector de Emissão Atômica) - Determina composição centesimal ANÁLISE TÉRMICA ATD/ATG - DSC - Determina decomposição da molécula; polimorfismo ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA Caso um proposta é obtida: o nome atribuído a impureza pode não ser comparado aos nomes existentes no mercado. (se houver)

23 T&E Analítica 2013 ENSAIOS FARMACÊUTICOS PARA TOXICIDADE GENÉTICA ANVISA : - RE 90- de 16 de março de 2004: Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos - Ofício Circular no 002/2009/GGTOX) Gerência Geral de Toxicologia Brasília 08/09/ GUIA PARA A CONDUÇÃO DE ESTUDOS NÃO CLÍNICOS DE SEGURANÇA NECESSÁRIOS AO DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTOS - Gerência de Avaliação de Segurança e Eficácia - GESEF Neles incluem-se: - toxicidade aguda - toxicidade de doses repetidas (longa duração) - estudo especial - Genotoxicidade Aqui Apresentados: 1- TOXICIDADE : Daphnia 2- TOXICIDADE : DL 50 e CL MUTAGENICIDADE : Ensaio de AMES 4- MUTAGENICIDADE : Ensaio Micronúcleo

24 T&E Analítica O ensaio de toxicidade só é possível com o isolamento da(s) espécie(s), o que é complexo, para ter massa suficiente para a identificação/quantificação e suficiente para toxicidade. Obs.: Uma substância testada em toxicidade isolada, pode não ser tóxica quando no formulado TOXICIDADE/GENOTOXICIDADE Genotoxicidade não e uma medida de Carcinogenicidade (Indicador para o câncer) Mutagenicidade mede evento inicial ou intermediário do processo de tumorigenese

25 T&E Analítica 2013 O ensaio consiste básicamente na exposição do microcrustáceo de água doce Daphnia magna em diferentes condições, visando assim a detectar seus efeitos letais e/ou subletais em estudos de avaliação de toxicidade TOXICIDADE AGUDA POR DAPHNIA O Ensaio: -para cada concentração observa-se a imobilidade e/ou a mortalidade dos indivíduos após o período de exposição de 24 e 48 horas, encerrando o teste após 48 horas. Resultados: Porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade / quantidade de indivíduos no início do ensaio Quanto maior a porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade dos indíviduos no tempo do ensaio, maior a toxicidade

26 T&E Analítica 2013 A morte é universal: Todas as drogas são capazes de causar a morte. A dose que causa a morte em 50% dos animais testados em determinado período de tempo é denominada de dose letal mediana (DL50). A relação entre esta dose e a dose efetiva mediana (DL50/DE50) define o índice terapêutico (IT). TOXICIDADE - DL 50 ( Dose Letal Média) Algumas substâncias já possuem literatura quanto a degradação e toxicidade destas impurezas. O ácido ascórbico tem sua degradação em 10% em massa inicial da seguinte forma: Vamos parar de consumir laranja, acerola, entre outras fontes da Vit C? ?

27 T&E Analítica 2013 O ensaio de AMES, determina mutagenicidade utilizando de Cepas (estirpes) Salmonella typhimurium. O ensaio mede a indução de mutações reversas em cepas auxotróficas (His-) para o aminoácido Histidina que revertem as mesmas à prototrofia (His+) (selvagem). MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE AMES

28 T&E Analítica 2013 O teste do micronúcleo, sendo um teste citogenético, consiste na investigação de células previamente expostas a agentes químicos, com a finalidade de detectar possíveis aberrações cromossômicas. O teste baseia-se num aumento da freqüência de eritrócitos policromáticos com micronúcleos, utilizando- se para isso, preferencialmente, células de mamíferos (medula óssea ou sangue periférico de animais devidamente tratados. (camundongos machos e jovens). Grupos de controle e experimental são distribuídos aleatoriamente, e dividem-se em: grupo controle negativo, grupo-controle positivo (administra-se substância reconhecidamente indutora de mutagênese p.ex ciclofosfamida 50mg/Kg) e grupo-teste (administra-se a substância teste ). Quantidade de coletas em tempos máximos determinados, devem ser rigorosamente observados. Os micronúcleos normalmente são visualizados usando-se de diferentes técnicas, entre elas a coloração de Giemsa ou a Fluorescência. A quantificação é por microscopia. MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE MICRONUCLEO

29 T&E Analítica 2013 ETAPA 1A- BUSCA DA IMPUREZA DE DEGRADAÇÃO CONSIDERANDO ENSAIOS TÉCNICA PERTINENTE (LC-DAD, HPLC-UV/Vis, CFG ou GC/MS) MP Ativo Tfinal PLACEBO Tfinal FORMULADO Tfinal BRANCO Stressante Teor Ativo (dupl) ANTES colocar as quantidades (tzero ) *Teor impurezas conhecidas antes Teor do ativo+Imp LUZ - FINAL de cada dia Teor do ativo+Imp UMIDADE - FINAL de cada dia Teor do ativo+Imp-TEMPERATURA - FINAL de cada dia (60oC) Teor do ativo+Imp-OXIDAÇÃO - FINAL 2 conc de cada dia Teor do ativo+Imp-HIDRO ÁCIDA- FINAL 2 conc de cada dia Teor do ativo+Imp- HIDRO BÁSICA- FINAL 2 conc de cada dia Teor ativo+Imp OXIREDUÇÃO-FINAL,2 conc,2 reagde cada dia Quantificação NOVAS Imp Fator Resposta Ativo ou Área% Incremento de análises diárias (1 a 20 dias) TOTAL ANÁLISES= MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO CP - 11 Prazo: 10 a 20 dias

30 T&E Analítica 2013 ETAPA 2- ISOLAMENTO IMPUREZA ENSAIOS PROVÁVEIS Quantidade de impurezas Impureza por TLC, CC ou LC/Prep ETAPA 3- PROPOSTA DE IDENTIFICAÇÃO DA IMPUREZA ENSAIOS PROVÁVEIS Quantidade de impurezas Impureza por DAD/MS/IV ETAPA 4- QUANTIFICAÇÃO FATOR RESPOSTA IMPUREZA ENSAIOS PROVÁVEIS Quantidade de impurezas Impureza por LC ou GC ETAPA 5- GENOTOXICIDADE ENSAIOS PROVÁVEIS Quantidade de Impurezas DL 50 Daphineas AMES Micronuclideo Outros métodos Prazo: 20 a 50 dias Prazo: 10 a 30 dias Prazo: 5 a 15 dias Prazo: 3 a 12 meses MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO CP 11

31 T&E Analítica 2013 PRINCIPAIS REFERÊNCIAS

32 T&E Analítica 2013 OBRIGADO Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP – Brasil Fone: (19) 3756 – 6600 Fax:


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