A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Petruccio Tenório Medeiros. CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Petruccio Tenório Medeiros. CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes."— Transcrição da apresentação:

1 Petruccio Tenório Medeiros

2 CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo CaCO 3 mistura de pigmentos separados Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego)

3 CROMATOGRAFIA Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

4 CROMATOGRAFIA Modalidades e Classificação FM = Líquido FM = Gás Cromatografia Líquida Cromatografia Gasosa (CG) Em CG a FE pode ser: Sólida Líquida Cromatografia Gás-Sólido (CGS) Cromatografia Gás-Líquido (CGL)

5 CROMATOGRAFIA GASOSA Histórico Presentemente: Vendas de equipamentos e acessórios para CG nos EUA estimadas em mais de US$ (1995) CGS rudimentar CGL proposta (Martin e Synge) Separação de ácidos orgâni- cos por CGL: primeiro cro- matógrafo (Martin e James) Primeiro equipamento comer- cial (Griffin & George) Detector por Densidade de Gás (Martin e James) Detector por Ionização em Chama (McWillian e Dewar) Detector por Captura de Eletrons (Lovelock e Lipsky) Colunas Capilares (Golay)

6 CROMATOGRAFIA GASOSA Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=evaporáveis) (para uma substãncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gás ela deve ser dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o C e que termicamente estáveis.

7 O Cromatógrafo a Gás Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). Observação: em vermelho: temperatura controlada

8 INSTRUMENTAÇÃO Gás de Arraste Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amos- GÁS DE ARRASTE tra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE Requisitos: INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCE H 2 O, O 2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

9 INSTRUMENTAÇÃO Gás de Arraste Requisitos: CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: He, H 2 DCT DIC N 2, H 2 DCE N 2 (SS), Ar + 5% CH 4 CUSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0)

10 INSTRUMENTAÇÃO Alimentação de Gás de Arraste Componentes necessários à linha de gás: controladores de vazão / pressão de gás dispositivos para purificação de gás (traps) Cilindro de Gás 2 - Regulador de Pressão Primário 3 - Traps para eliminar impurezas do gás 4 - Regulador de Pressão Secundário 5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo) 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro) Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre

11 INSTRUMENTAÇÃO Dispositivos de Injeção de Amostra Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica Injeção instantânea: Injeção lenta: t = 0 t = x t = 0 t = x

12 INSTRUMENTAÇÃO Injetor on-column Convencional Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica

13 INSTRUMENTAÇÃO Injeção on-column de líquidos Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna. 3 - Plug de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

14 INSTRUMENTAÇÃO Parâmetros de Injeção TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser sufi- cientemente elevada para que a amostra vapo- rize-se imediatamente, mas sem decomposição Regra Geral: T inj = 50 o C acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra COLUNA Amostras Gasosas Amostras Líquidas empacotada = 3,2 mm ( 1 / 4 ) 0,1 ml mL 0,2 L L capilar = 0,25 mm 0,001 ml... 0,1 mL 0,01 L... 3 L Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

15 INSTRUMENTAÇÃO Microsseringas para Injeção LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Microseringa de 10 L: Microseringa de 1 L (seção ampliada): corpo guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) agulha

16 INSTRUMENTAÇÃO Colunas: Definições Básicas EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pul- verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recober- tas com um filme fino (fra- ção de m) de FE líquida ou sólida

17 INSTRUMENTAÇÃO Temperatura da Coluna Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p 0 ). p 0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDA- MENTE (MENOR RETENÇÃO)

18 INSTRUMENTAÇÃO Temperatura da Coluna TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG

19 INSTRUMENTAÇÃO Forno da Coluna Características Desejáveis de um Forno: AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE USO Pelo menos de T ambiente até 400 o C. Sistemas criogênicos (T < T ambiente ) podem ser necessários em casos especiais. TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MÓDULOS Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector. TEMPERATURA UNIFORME EM SEU INTERIOR Sistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno.

20 INSTRUMENTAÇÃO Forno da Coluna Características Desejáveis de um Forno: FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente. AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas. TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C. Em cromatógrafos modernos (depois de 1980), o controle de temperatura do forno é totalmente operado por microprocessadores.

21 INSTRUMENTAÇÃO Forno da Coluna Características Desejáveis de um Forno: FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente. AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas. TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C. Em cromatógrafos modernos (depois de 1980), o controle de temperatura do forno é totalmente operado por microprocessadores.

22 INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: T COL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos volá- teis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos T COL ALTA: - Componentes mais volá- teis não são separados - Componentes menos volá- teis eluem mais rapidamente

23 INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TEMPO TEMPERATURA t INI t FIM T INI T FIM R Parâmetros de uma programação de temperatura: T INI Temperatura Inicial T FIM Temperatura Final t INI Tempo Isotérmico Inicial t FIM Tempo Final do Programa R Velocidade de Aquecimento

24 INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidadevazão DERIVA (DRIFT) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida

25 INSTRUMENTAÇÃO Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da pas- sagem de substâncias que não o gás de arraste Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

26 INSTRUMENTAÇÃO Detectores Mais Importantes: DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS ( DCE OU ECD ) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA ( DCT OU TCD ) Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA ( DIC OU FID ) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H 2 + ar. REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores

27 TEORIA BÁSICA Tempo de Retenção Ajustado, t R tRtR tMtM t R = t R - t M TEMPO SINAL t R = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in- jeção e o ápice do pico cromatográfico) t M = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) t R = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE) O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, t R :

28 TEORIA BÁSICA Volume de Retenção Ajustado, V R Embora não diretamente mensurável, o parâ- metro fundamental de retenção é o VOLUME DE RETENÇÃO AJUSTADO, V R : vazão do gás de arraste x V R = Volume de Retenção (volume de gás de arraste necessário para eluir um analito) V M = Volume de Fase Móvel (volume de gás de ar- raste contido na coluna; volume morto) V R = Volume de Retenção Ajustado (volume de gás de arraste consumido enquanto o analito está sorvido na FE) V R = f Fatores termodinâmicos Parâmetros dimensionais da coluna

29 TEORIA BÁSICA Constante de Distribuição, K C Coluna cromatográfica: série de estágios inde- pendentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste: Ocorre um quase-equilíbrio en- tre o analito sorvido na FE e dis- solvido no gás de arraste. K C = Constante de Distribuição [A] S = concentração do analito na FE [A] M = concentração do analito no gás MENOR RETENÇÃO !!! Volatilidade [A] M Afinidade pela FE [A] S

30 TEORIA BÁSICA Fator de Retenção, k Exprimindo o equilíbrio em termos da MASSA do analito em cada fase, ao invés da concentração: FATOR DE RETENÇÃO, k: razão entre as massas de analito contidas na FE (W s ) e gás de arraste (W M ) RAZÃO DE FASES, : razão entre volumes de FE e gás de arraste na coluna O fator de retenção k depen- de da constante termodi- nâmica de distribuição K C e da razão de fases da coluna

31 TEORIA BÁSICA Razão de Fases, Depende das DIMENSÕES da coluna: L = comprimento da coluna r C = raio da coluna d f = espessura do filme de FE r C >> d f Valores de para colunas capilares de dimensões típicas: Empacotadas: 5 < < 50

32 TEORIA BÁSICA Relações entre V R, K C e V R pode ser definido em função de K C e V R depende diretamente da constante de dis- tribuição do soluto entre a FE e o gás de arraste e das dimensões da coluna. Outra combinação possível: É possível estimar tanto o fator de retenção quanto a constante de distribuição a partir do cromatograma

33 TEORIA BÁSICA Eficiência de Sistemas Cromatográficos A migração um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda: TEMPO Efeitos do alargamento excessivo de picos: Separação deficiente de analitos com retenções próximas. Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

34 TEORIA BÁSICA Quantificação da Eficiência Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e o gás de arraste: Cada estágio de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO O número de pratos teó- ricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Coluna mais eficiente tRtR wbwb N

35 TEORIA BÁSICA Quantificação da Eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRI- CO (H) Tamanho de cada estágio de equilíbrio Valores típicos de H e N: Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes (L = comprimento da coluna)

36 TEORIA BÁSICA Otimização da Eficiência A altura equivalente a um prato téorico é função da velocidade linear média do gás de arraste u : H u u MAX H MIN O valor de H pode ser minimizado otimizando- se a vazão de gás de arraste Relações algébricas entre H e u: - Colunas Empacotadas: Equação de van Deemter - Colunas Capilares: Equação de Golay (A, B, C = constantes)(B, C M, C S = constantes)

37 FASES ESTACIONÁRIAS Conceitos Gerais LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só- lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares) FE líquida SUPORTE Sólido inerte poroso Tubo capilar de material inerte SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfície interna do tubo (capilar) Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é: Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente ligadas entre si Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas são presas ao suporte por ligações químicas

38 FASES ESTACIONÁRIAS Características de uma FE ideal SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático...) FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência

39 FASES ESTACIONÁRIAS Características de uma FE ideal AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimização da separação. BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases) DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência de picos fantasma nos cromatogramas.

40 FASES ESTACIONÁRIAS FE Sólidas: Adsorção O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida ADSORÇÃO Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) Solutos polares Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)

41 FASES ESTACIONÁRIAS FE Sólidas Características Gerais: - Sólidos finamente granulados (diâmetros de par- tículas típicos de 105 µm a 420 µm). - Grandes áreas superficiais (até 10 2 m 2 /g). Mais usados: Polímeros Porosos Porapak (copolímero estireno-divi- nilbenzeno), Tenax (polióxido de difenileno) Sólidos Inorgânicos Carboplot, Carboxen (carvões ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa) GASES DE REFINARIA Coluna:Carboxen mesh; 15 x 1/8 T COL : 35 o C a 225 o C / 20 o C. min -1 Gás de Arraste: 30 ml.min -1 Detector: TCD Principais Aplicações: - Separação de gases fixos - Compostos leves - Séries homólogas

42 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.) Estrutura Química: AMINAS ALIFÁTICAS Coluna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH T COL : 200 o C (isotérmico) Gás de Arraste: N 20 mL.min -1 Detector: FID Amostra: 0,01 L da mistura de aminas

43 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas Maior parte das aplicações em CG moderna Quatro grandes grupos estruturais: PARAFINAS Apolares; alta inércia química; praticamente abandonadas. Principais: esqua- lano (C 30 H 62 ), Apiezon (graxas para vácuo). POLIÉSTERES Ésteres de diálcoois com di- ácidos. Polares; altamente sensíveis a umidade e oxidação; uso em declínio. Principais: DEGS, EGA, EGS. ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAXOS Coluna:5%DEGS-PS s/ Supel- coport 100/120 mesh; 6 x 1/8 T COL : 200 o C (isotérmico) Gás de Arraste: N 20 ml.min -1 Detector: FID Amostra: 0,5 L de solução em clorofórmio contendo 0,5 g de cada éster

44 FASES ESTACIONÁRIAS FE Líquidas: Absorção O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) ABSORÇÃO Filmes espessos de FE líquida Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade) Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste

45 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas SILICONES (polisiloxanas) As FE mais em- pregadas em CG. Cobrem ampla faixa de pola- ridades e propriedades químicas diversas. R 1, R 2 = qualquer radical orgânico - Ligação Si-O extremamente estável = elevada estabilidade térmica e química das FE. - Silicones são fabricados em larga escala para diversas aplicações = minimização de custo do produto + tecnologia de produção e purificação largamente estudada e conhecida. - Praticamente qualquer radical orgânico ou inorgânico pode ser ligado à cadeia polimérica = FE ajustáveis a separações específicas + facilidade de imobilização por entrecruzamento e ligação química a suportes

46 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas FE derivadas de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituição de -CH 3 por radicais orgânicos, em ordem crescente aproximada de polaridade: Diferenças entre FE de composição similar provenientes de fornecedores diferentes: pureza, viscosidade.

47 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS 1 - TCNB 2 - Dichloram 3 - Lindano 4 - PCNB 5 - Pentacloroanilina 6 - Ronilano 7 - Antor 8 - pp-DDE 9 - Rovral 10 - Cypermetrin 11 - Decametrin Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m) T COL :195 o C (6,5 min) / 195 o C a 275 o C (10 o C.min -1 ) Gás de Arraste: 35 cm.min -1 Detector: FID Amostra: 2 L de solução dos pesticidas on-column 17 min

48 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone 1 - piridina metilpiridina 3 - 2,6-dimetilpiridina etilpiridina metilpiridina metilpiridina 3 min Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m) T COL :110 o C (isotérmico) Gás de Arraste: N 16 cm.min -1 Detector: FID Amostra: 0,1 L de solução 1-2% das piridinas em 3-metilpiridina

49 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones 50% Ph 50% Me 5% Ph 95% Me

50 FASES ESTACIONÁRIAS FE Quirais Separação de isômeros óticos: FÁRMACOS Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica. PRODUTOS BIOLÓGICOS Distinção entre pro- dutos de origem sintética e natural (natural = normal- mente substâncias oticamente puras; sintético = mui- tas vezes são misturas racêmicas). Propriedades físico-químicas de isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais não interagem diferencialmente com isômeros óticos Separação de misturas de isômeros óticos só é possível com FE oticamente ativas = FE Quirais

51 FASES ESTACIONÁRIAS FE Quirais FE oticamente ativas mais importantes: Chiralsil-Val Derivados de aminoácidos: Misturas de compostos formadores de pontes de hidrogênio. Organometálicos: Separação de enantiômeros formadores de complexos. / 2 Chiralsil-Metal

52 FASES ESTACIONÁRIAS FE Quirais Derivados de ciclodextrinas alquiladas: -ciclodextrina: oligosacarídeo cíclico quiral Chiralsil-Dex - Introduzidas em Quando ligadas a cadeias de polisiloxano: uso extremamente favorável como FE líquida (viscosidade baixa, estabilidade...) - Podem ser quimicamente imobilizadas nas colunas - Colunas disponíveis comercialmente

53 FASES ESTACIONÁRIAS FE Quirais: Aplicações Óleo essencial artificial de limão: separação de terpenos primários 1 - (+/-) -pineno 2 - sabineno 3 - (+/-) -pineno 4 - (+/-) limoneno Coluna: Rt-ßDEXsm (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm) T COL : 1 min a 40°C / 2°C min -1 / 3 min a 200°C Gás de Arraste: H 80 cm.min -1 Detector: FID

54 FASES ESTACIONÁRIAS FE Quirais: Aplicações Óleo essencial naturalEssência artificial Aroma de bergamota: distinção entre aroma natural e artificial Coluna: Rt-ßDEXse (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm) T COL : 1 min a 40°C / 4°C min -1 / 200°C Gás de Arraste: 80 cm.min -1 Detector: MS

55 FASES ESTACIONÁRIAS FE Quirais: Aplicações Anfetaminas: resolução dos isômeros Coluna: Rt-ßDEXcst (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) T COL : 1 min a 120°C / 1,5°C min -1 / 3 min A 175°C Gás de Arraste: 25 cm.min -1 Detector: MS

56 COLUNAS EMPACOTADAS Definições Básicas Tubo de material inerte recheado com FE sólida gra- nulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido. MATERIAL DO TUBO ø = 3 mm a 6 mm L = 0,5 m a 5 m aço inox vidro pirex níquel TEFLON Granulometria do recheio mesh m mesh m mesh m MESH dpdp Eficiência maximizada com: - Diminuição de d C - Diminuição de d p - Recheio regular Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste

57 COLUNAS EMPACOTADAS FE Líquidas: Suporte A FE líquida deve ser disposta sobre um SUPORTE sólido área superficial entre 0,5 e 10 m 2.g -1 microporos regulares (~ 1 m) NÃO interagir com a amostra boa resistência mecânica Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA Esqueletos fósseis (SiO 2 + óxidos metálicos) de algas microscópicas Chromosorb Anachrom Supelcoport... secagem calcinação fusão com soda lavagem com ácido silanização

58 COLUNAS EMPACOTADAS FE Líquidas: Suporte Chromosorb - características gerais Ordem crescente de inércia Tratamentos especiais: AW Lavado com ácido, para remoção de metais HP ou DMCS ou HDMS Silanizados (menor adsorção) NAW Sem lavagem com ácido Chromosorb P Róseo, muito ativo. Chromosorb W Branco, mais inerte que o P. Chromosorb G Similar ao W, maior resistência mecânica

59 COLUNAS EMPACOTADAS FE Líquidas: Carga de FE TIPICAMENTE % FE = 1 % a 30 % do recheio Maiores volumes de amostra Melhor blindagem dos sítios adsortivos do suporte Melhor reprodutibilidade no preparo do recheio Maior eficiência ( d f = N) Menor sangria da FE com temperatura programada Separações rápidas e em temperaturas menores % FE d f = f (% FE no recheio)

60 COLUNAS CAPILARES Definições Básicas Tubo fino de material inerte com FE líquida ou sólida depositada sobre as paredes internas. MATERIAL DO TUBO ø = 0,1 mm a 0,5 mm L = 5 m a 100 m sílica fundida vidro pirex aço inox Nylon Silcosteel Colunas de sílica são revestidas externamente com camada de polímero (poliimida) para aumentar resistência mecânica e química Colunas Capilares x Empacotadas: CAPILARES L = N Colunas mais eficientes F C = mL.min -1 Controle de vazão mais difícil V i Dispositivos especiais de injeção Famílias de Colunas Capilares : PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE sólida presa às paredes internas SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas com material de recheio similar ao das colunas empacotadas WCOT (Wall coated open tube) FE liquida deposida (ligada // entrecruzada) sobre as paredes internas.

61 COLUNAS CAPILARES Diâmetro Interno d C = Eficiência 0,10 mm 0,25 mm 0,32 mm 0,53 mm Valores comuns: 1 Colunas de altíssima eficiência (amostras complexas, Fast GC); capacidade volumétrica limitada de processamento de amostra 2 Diâmetros mais comuns; capacidade volumétrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeção 3 Colunas megabore: menor eficiência, mas maior capacidade de processamento permite uso de injetores convencionais

62 COLUNAS CAPILARES Fast GC: Colunas Capilares Finas Destilação simulada de óleo diesel: Coluna: HP-1 (1 m x 0.10 mm x 0.40 µm) T COL : 35°C / 40°C min -1 / 0,75 min A 310°C Gás de Arraste: 90 ml.min -1 Detector: FID Além de colunas finas: necessário controle acurado de vazão (controle eletrônico de pressão) e altas velocidades de aquecimento da coluna.

63 COLUNAS CAPILARES Colunas Capilares: Injeção Septo; 2 - Entrada de gás de arraste; 3 - Liner (misturador); 4 - Coluna Capilar 5 - Purga de gás de arraste; 6 - Válvula de controle de purga. Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro) Injeção direta com microseringa muito difícil !!! Injetores com divisão (splitters) Sistema pneumático despreza fração da amostra injetada - Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada) - Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis é sempre menor) - Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros

64 COLUNAS CAPILARES Large Volume Injection (LVI) Combinando injetores com temperatura programada, vál- vulas controladas por microprocessador e pré-colunas pode ser feita injeção de grandes volumes (> 100 L) de amostra 1 Colunas e injetor frios; válvula de purga aberta (solvente é eliminado) 2 Colunas e injetor aquecidos; válvula de purga fechada (constituintes de interesse transferidos para coluna analítica)

65 COLUNAS CAPILARES Large Volume Injection (LVI) Separação de PAH com LVI (V inj = 25 L, solução 400 ppb em CH 2 Cl 2 ) Coluna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) T COL : 5 min a 50°C / 20°C min -1 / 2 min A 320°C Gás de Arraste: 2 ml.min -1 Detector: FID

66 COLUNAS CAPILARES Colunas Multicapilares Feixes paralelos de colunas capilares com d C convencional - Eficiência próxima à das colunas convencionais - Capacidade similar à das colunas empacotadas - Colunas mais curtas: análises mais rápidas Separação de explosivos em coluna multicapilar (OV-17, 1000 capilares x 6 m) 1 - 2,6-DNT 2 - 2,4-DNT 3 - 2,4,6-TNT 4 - 3,4,5-TNT 5 - 2,3,4-TNT 6 - RDX ? 7 - tetryl

67 DETECTORES Definições Gerais Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluida de um analito ~ 60 detectores já usados em CG ~ 15 equipam cromatógrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicações DCT TCD Detector por Condutividade Térmica DIC FID Detector por Ionização em Chama DCE ECD Detector por Captura de Eletrons EM MS Detector Es- pectrométrico de Massas

68 DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído SINAL (S) RUÍDO (N) = 3 S N RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra Fontes de Ruído Contaminantes nos gases Impurezas acumuladas no detector Aterramento elétrico deficiente

69 DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho LIMITE DE DETEÇÃO Quantidade de analito que gera um pico com S/N = 3 e w b = 1 unidade de tempo Mesmo detector, nível de ruído e massa de analito MAS diferentes larguras de base: wbwb QMD = f Detector (sinal gerado, ruído) Largura do pico cromatográfico Definindo limite de detecção como: LD é independente da eficiência do sistema cromatográfico ! [QMD] = massa (ng, pg...) [LD] = massa / tempo (ng.s -1, pg.s -1...)

70 DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho VELOCIDADE DE RESPOSTA Tempo decorrido entre a entrada do analito na cela do detector e a geração do sinal elétrico. 63,2% FSD TEMPO SINAL Constante de Tempo, : tempo necessário para o sinal chegar a 63,2 % FSD (full scale deflection = fundo de escala) após a entrada de amostra A constante de tempo do sistema (detector + dispositivos de registro de sinal) igual ou menor a 10% da largura a meia altura (w 0.5 ) do pico mais estreito do cromatograma >> w 0.5 t R medido > t R real w medida > w real Deformação no pico (cauda) Diminuição do ruído (damping)

71 DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho SENSIBILIDADE Relação entre o incremento de área do pico e o incremento de massa do analito MASSA ÁREA Fator de Resposta, S: inclinação da reta Área do pico x Massa do analito o mesmo incremento de massa causa um maior incremento de área Sensibilidade S Na ausência de erros determinados: A = área do pico cromatográfico m = massa do analito

72 DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho FAIXA LINEAR DINÂMICA Intervalo de massas dentro do qual a resposta do detector é linear MASSA ÁREA A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear: MASSA ÁREA / MASSA 0,95 S 1,05 S

73 DETECTORES Classificação UNIVERSAIS : Geram sinal para qualquer substância eluida. SELETIVOS : Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS : Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

74 DETECTORES Detector por Condutividade Térmica PRINCÍPIO Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito. Cela de Detecção do DCT: i 1 Bloco metálico (aço) 2 Entrada de gás de arraste 3 Saída de gás de arraste 4 Filamento metálico (liga W- Re) aquecido 5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento A taxa de transferência de calor entre um corpo quente e um corpo frio depende da condutividade térmica do gás no espaço que separa os corpos Se a condutividade térmica do gás diminui, a quantidade de calor transferido também diminui - o corpo quente se aquece.

75 DETECTORES Detector por Condutividade Térmica Configuração tradicional do DCT: bloco metálico com quatro celas interligadas em par - por duas passa o efluente da coluna e por duas, gás de arraste puro: CELAS DA AMOSTRA CELAS DE REFERÊNCIA CORTE SUPERIOR CELAS DA AMOSTRA CELAS DE REFERÊNCIA CORTE LATERAL Quando da eluição de um composto com condutividade térmica menor que a do gás de arraste puro: Diferença de resistência elétrica entre os filamentos de amostra e referência Filamentos nas celas de amostra se aquecem Resistência elétrica dos filamentos nas celas de amostra aumenta Filamentos nas celas de referência não se aquecem Resistência elétrica dos filamentos nas celas de referência fica constante

76 DETECTORES Detector por Condutividade Térmica Os filamentos do DCT são montados numa ponte de Wheatstone que transforma a diferença de resistência quando da eluição de amostra numa diferença de voltagem: V Fonte de CC / Bateria (18 V a 36 V, típico) F Ajuste da corrente nos filamentos I Medida da corrente nos filamentos (100 mA mA, típico) B 1 B 2 Balanceamento / ajuste de zero R 1 R 2 Filamentos das celas de referência A 1 A 2 Filamentos das celas de amostra

77 DETECTORES Características Operacionais do DCT SELETIVIDADE Observa-se sinal para q ualquer subs- tância eluida diferente do gás de arraste = UNIVERSAL SENSIBILIDADE / LINEARIDADE Dependendo da configuração particular e do analito: QMD = 0,4 ng a 1 ng com linearidade de 10 4 (ng - dezenas de g) VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE O sinal é proporcional à concentração do analito no gás de arraste que passa pela cela de amostra. VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE CONSTANTE DURANTE A ELUIÇÃO VARIAÇÃO DA VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE DURANTE A ELUIÇÃO F c = 0 Com DCT, a área dos picos cromatográficos é MUITO dependente da vazão do gás de arraste !!!

78 DETECTORES Características Operacionais do DCT NATUREZA DO GÁS DE ARRASTE Quanto maior a diferença entre a condutividade térmica do gás de arraste puro, A, e do analito, X, maior a resposta. QUANTO MENOR A MASSA MOLECULAR DO GÁS DE ARRASTE, MAIOR A RESPOSTA Como: (M = massa molecular) Gás de arraste com DCT: He ou H 2 outro gás 1 2 He ou H Usando He ou H 2 como gás de arraste, é maximizado: MAIOR RESPOSTA 2 Com outros gases, eventualmente X > A : PICOS NEGATIVOS

79 DETECTORES Características Operacionais do DCT FATORES DE RESPOSTA Quanto menor a condutividade térmica do analito, maior o sinal. Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picos cromatográficos com áreas diferentes !!! Os fatores de resposta dependem da condutividade térmica do analito Mistura de quantidades equimolares de: Etano = 17,5 Clorofórmio = 6,0 Etanol = 12,7 C2H6C2H6 CHCl 3 C 2 H 5 OH X

80 DETECTORES Características Operacionais do DCT TEMPERATURAS DE OPERAÇÃO Quanto maior a diferença entre a temperatura dos filamentos e do bloco metálico maior a resposta. Temperatura do filamento, T F : entre 300 o C e 350 o C. É função da corrente de alimentação dos filamentos, i. i TFTF Sinal Limitações: - Correntes excessivas podem fundir o filamento (Ø típicos do filamento = 20 m) - Diminuição do tempo de vida útil dos filamentos (oxidação por traços de O 2 no gás de arraste) Temperatura do bloco, T B : mantida tão baixa quanto possível TBTB Sinal Limitação: - Temperaturas excessivamente baixas podem provocar a condensação de analitos nas celas (erros analíticos, danos aos filamentos)

81 DETECTORES DCT: Aplicações 1 Separação e quantificação de compostos que não geram sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos) 2 Por ser um detector não-destrutivo, pode ser usado em CG preparativa ou detecção sequencial com dois detectores em tandem Coluna: CP Sil 5CB (50 m x 0.32 mm x 5 µm) Gás de Arraste: 3 ml.min -1 T COL : 4 0°C Detector: DCT 1 N 2 2 CH 4 3 CO 2 4 n-C 2 5 NH 3 6 n-C 3 7 i-C 4 8 n-C 4 Separação de Gases Fixos e Hidrocarbonetos:

82 DETECTORES Detector por Ionização em Chama PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio O efluente da coluna é misturado com H 2 e O 2 e queimado. Como numa chama de H 2 + O 2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica. Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica

83 DETECTORES Detector por Ionização em Chama COLETOR FLAME TIP BLOCO AR H2H2 COLUNA O ar e o H 2 difundem para o interior do coletor, onde se misturam ao efluente da coluna e queimam: Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o flame tip e o coletor - quando se formam íons na chama, flue uma corrente elétrica:

84 DETECTORES Detector por Ionização em Chama Química da Chama de Hidrogênio: Incandescência Reação Quebra Estrutura da chama três regiões básicas Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H 2, O 2 e dos analitos. Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO 2 (provenientes do H 2 ), CH e C 2 (proveniente do analito) e íons CHO + (analito). Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), C H e C2 (visível). Queima de substâncias com ligações C-H CH + O CHO + + e - 1 íon formado a cada ~10 5 átomos de C queimados Queima de H 2 Formam-se apenas radicais !!!

85 DETECTORES Características Operacionais do DIC SELETIVIDADE Seletivo para substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura química. (como virtualmente todas as substâncias analizáveis por CG são orgânicas, na prática o DIC é UNIVERSAL ) Compostos que NÃO produzem resposta no DIC: Gases nobres H 2, O 2, N 2 CO, CO 2, CS 2 CCl 4, peralogenados NH 3, N x O y SiX 4 (X = halogênio) H2OH2O HCOOH, HCHO * SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD típicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 10 7 e 10 8 (pg a mg) DIC DCT N2N2 CH 4 CO 2 O2O2

86 DETECTORES Características Operacionais do DIC VAZÕES DE GASES Além do gás de arraste, as vazões de alimentação de ar (comburente) e hidrogênio (combustível) devem ser otimizadas. Gráficos Sinal x Vazão de Gases típicos: SINAL ARH2H2 O sinal se mantém aproximadamente constante em uma larga faixa de vazões de ar e H 2 VARIAÇÕES NAS VAZÕES DE AR E H 2 AFETAM APENAS MARGINALMENTE O SINAL = MAIORES REPRODUTIBILIDADE E REPETIBILIDADE

87 DETECTORES Características Operacionais do DIC TEMPERATURA DE OPERAÇÃO O efeito da temperatura sobre o sinal do DIC é negligenciável. TRATAMENTO DE SINAL Por causa da baixa magnitude da corrente elétrica gerada (pA a nA) ela deve ser amplificada para poder ser registrada Diagrama eletrônico simplificado de um DIC 1 Flame tip / Chama / Coletor 2 Bateria ou Fonte de CC Voltagens de operação normais de 200 V a 300 V (não variável - valor depende da geometria específica do detector). 3 Amplificador Eletrométrico Deve amplificar o sinal e converter uma corrente variável em uma voltagem variável (pA mV). 4 Saída de Registro de Sinal

88 DETECTORES Características Operacionais do DIC FATORES DE RESPOSTA O fator de resposta de um determinado composto é aproximadamente proporcional ao número átomos de carbono. Presença de heteroelementos diminui o fator de resposta. Número Efetivo de Carbonos (NEC) Prevê com ~20% de aproximação o fator de resposta de um composto. (X = Contribuição de cada átomo ao NEC) C 2 H 6 NEC = 2,00 C 2 H 5 OH NEC = 1,40 CH 3 CHO NEC = 1,00 Mistura com quantidades equimolares de:

89 DETECTORES Detector de Nitrogênio - Fósforo Modificação do DIC altamente seletiva para compostos orgânicos nitrogenados e fosforados Pérola de sal de metal alcalino: RbCl (normal), KCl Seletividade S para fosforados ou nitrogenados: x x em relação a hidrocarbonetos similares QMD = 0,4 pg a 10 pg (N) e 0,1 a 1 pg (P) Pesticidas Triazínicos usando DNP: 1Desetilatrazina 2Desisopropilatrazina 3Atraton 4Atrazina 5Trietazina 6 Secbumeton 7Sebutilazina 8Simetrin 9Dipropretrina 10Dimetametrina 11Metroprotrina (100 pg cada)

90 DETECTORES Detector por Captura de Eletrons PRINCÍPIO Supressão de um fluxo de eletrons lentos (termais) causada pela sua absorção por espécies eletrofílicas Um fluxo contínuo de eletrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa -emissora) e um catodo. Na passagem de uma substância eletrofílica alguns eletrons são absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica.

91 DETECTORES Detector por Captura de Eletrons Anôdo (fonte radioativa - emissora) 2 Saída de gases 3 Catodo 4 Cavidade 5 Coluna cromatográfica

92 DETECTORES Detector por Captura de Eletrons Mecanismo de Captura de Eletrons 1 Geração de eletrons lentos pela interação entre a ra- diação moléculas do gás de arraste G e molécu- las de bloqueador (quencher) Q - + G G + + e - + e* energia - + G G* + Q G + e - + Q energia 2 Eletrons lentos são capturados pela espécie eletro- fílica AB AB + e - AB - + energia O decréscimo na corrente elétrica fluindo pela cela de detecção é proporcional à concentração a da espécie absorvente no gás de arraste I b corrente de repouso I e corrente na eluição do analito K constante de captura

93 DETECTORES Características Operacionais do DCE FONTE RADIOATIVA O anôdo deve estar dopado com um isótopo radioativo - ou - emissor Emprego universal em DCE comerciais: 3 H ( -, 0,02 MeV) Sob a forma de Ta 3 H 3 T det deve ser < 225 o C Maior sensibilidade 63 Ni ( -, 0,06 MeV) Usado como 63 Ni 0 Maior linearidade Útil até ~400 o C 85 Kr, 90 Sr, 99 Tc, 147 Pm, 241 Am, 226 Ra Raramente usados: 63 Ni preferido em equipamentos modernos - Maior durabilidade (t 1/2 = 100 a x 12 a para 3 H) - Maior estabilidade térmica - Menor risco de uso (radioatividade)

94 DETECTORES Características Operacionais do DCE TEMPERATURA DO DETECTOR Dependência do sinal com temperatura de operação bastante significativa Variação de 3 o C na temperatura Erro de ~ 10% na área dos picos Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado ! POLARIZAÇÃO DOS ELETRODOS Vários modos de polarização possíveis VOLTAGEM PULSADA Menos anomalieas elétricas: maior sensibilidade e linearidade. VOLTAGEM CONSTANTE Pouco usada modernamente - picos cromatográficos podem ser deformados. TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGIDAMENTE CONTROLADA

95 DETECTORES Características Operacionais do DCE GÁS DE ARRASTE Funcionamento do DCE é muito dependente da natureza do gás de arraste MAIS USADOS: N2N2 Ar + 5% CH 4 Geram eletrons lentos quando bom- bardeados com - O gás deve ser o mais puro possível !!! (traços de H 2 O e O 2 comprometem o sinal do DCE) VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE Sinal depende dire- tamente da vazão de gás fluindo no detector Sinal F ! Adsorção de contaminantes sobre os eletrodos causa deformação nos picos

96 DETECTORES Características Operacionais do DCE SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidade ~ 10 4 (pg a ng) 10 fg Lindano (C 6 H 6 ) -ECD HP-6890 PESTICIDAS 1 tetracloro-m-xileno 2 - BHC 3 Lindano 4 Heptachlor 5 Endosulfan 6 Dieldrin 7 Endrin 8 DDD 9 DDT 10 Metoxychlor 10 decaclorobifenila ~250 fg cada analito O DCE É O DETECTOR PREFERENCIAL PARA ANÁLISES DE TRAÇOS DE ORGANOALOGENADOS E SIMILARES

97 DETECTORES Características Operacionais do DCE SELETIVIDADE / FATORES DE RESPOSTA Valores de S maximizados para compostos eletrofílicos hidrocarbonetos e esteres alifáticos, dienos álcoois, cetonas e aldeídos alifáticos, aminas, nitrilas, mono - Cl, mono - F enóis, oxalatos, mono - Br, di - Cl, hexa - F tri - Cl, cloretos de ácidos, alquil - Pb, anidridos mono - I, di - Br, tri - Cl, mono - nitro, CS 2 di - I, tri - Br, poli - Cl, di - nitro, 1,2 - dicetonas, fumaratos, organo - Hg S típicos (clorobenzeno: S = 1) Comparando-se organoalogenados: I > Br > Cl > F Terc > Sec > Prim Tri > Di > Mono > > trans > cis

98 DETECTORES DCE: Aplicações Contaminantes em ar atmosférico - detecção paralela DIC + DCE DIC DCE 1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromáticos 4, 5, 6 - Hidrocarbonetos clorados

99 ANÁLISE QUALITATIVA Conceitos Gerais Fontes de Informações Qualitativas RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas Identificação individual das espécies contidas na amostra Determinação da identidade da amostra propriamente dita Aplicações Qualitativas de CG Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação de dados provenientes de pelo menos duas fontes

100 ANÁLISE QUALITATIVA Tempos de Retenção t R = f Interações analito / FE Pressão de vapor do analito Condições operacionais (T COL, F C...) Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito

101 ANÁLISE QUALITATIVA Tempos de Retenção Identificação por t R é muito pouco confiável: Dependência com F C e T COL Variações nestas condições afetam sensivelmente os t R VARIAÇÃO DE 1% NO t R T COL = 0,1% F C = 1% Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa de material eluido deforma o pico croma- tográfico e altera o seu t R MASSA Saturação da coluna cromatográfica com aumento de massa eluida provoca cauda frontal no pico

102 ANÁLISE QUALITATIVA Tempos de Retenção Comparação de t R usando dopagem (spiking) da amostra com o analito suspeito: aumento da confiabilidade de identificação. Amostra complexa: incerteza nos tR medidos pode levar a identificação errônea Comparação com cromatograma da amostra dopada permite identificação mais confiável do desconhecido

103 ANÁLISE QUALITATIVA Índice de Retenção de Kovàts FUNDAMENTO Os t R isotérmicos para uma série homóloga de compostos dependem logaritmicamente do número de átomos de carbono na cadeia. Separação isotérmica de uma mistura de n-alcanos (n-C 4, n-C 5,... n-C 16 ) Um gráfico de log(t R ) em função do número de átomos de carbono do analito n C é LINEAR

104 ANÁLISE QUALITATIVA Índice de Retenção de Kovàts O índice de retenção de Kovàts I para um analito é definido por: t R (A) Tempo de retenção ajustado do analito A t R (N) Tempo de retenção ajustado do n-alcano com N carbonos t R (n) Tempo de retenção ajustado do n-alcano com n carbonos (n = N + 1) Ex.: um analito com I = 874 teria um tempo de retenção ajustado equivalente ao de um n-alcano hipotético com cadeia de 8,74 átomos de carbono Interpolação logarítmica dos t R

105 ANÁLISE QUALITATIVA Índice de Retenção de Kovàts REPETIBILIDADE - REPRODUTIBILIDADE Os efeitos de T COL e F C nos índices de Kovàts são pequenos Dependência de I para algumas substâncias em uma coluna apolar na faixa de T COL = 70 o C a T COl = 130 o C Identificação por índices de retenção é muito confiável que comparações baseadas em t R ÍNDICE DE RETENÇÀO DE KRATZ Para programação linear de temperatura a relação entre t R e n C é linear: cálculo dos índices de retenção é modificado

106 ANÁLISE QUALITATIVA Retention Time Locking (RTL) PRINCÍPIO Em cromatógrafos com: controles pneumáticos e térmicos microprocessados, injetores automáticos e colunas cromatográficas de qualidade excepcional é possível alta repetibilidade nos t R CORRIDA #1 T COL (1) F C (1) Coluna A CORRIDA #2 T COL (2) F C (2) Coluna B O software RTL (Hewlett-Packard) automaticamente ajusta as condições operacionais em um segundo CG para reproduzir os t R obtidos em um primeiro equipamento Cromatogramas obtidos em diferentes equipamentos e colunas com condições operacionais da segunda corrida ajustadas pelo software de RTL

107 ANÁLISE QUALITATIVA Métodos de Detecção Qualitativos Métodos de detecção que fornecem informações qualitativas sobre os analitos eluídos: Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Absorção no Infra- Vermelho (CG-EIV) Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica de Massas (CG-EM) Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA) Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção

108 ANÁLISE QUALITATIVA Espectrometria de Massas PRINCÍPIO A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão característico da espécie química. 1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact = EI) ou íons (chemical ionization = CI): ABCDE + e - ABCDE e - 2 O íon formado se fragmenta: ABCDE. + AB. + CDE + ABCDE. + AB + + CDE. ABCDE. + A + + BCDE. 3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados: ABUNDÂNCIA MASSA / CARGA O gráfico do número de íons formados em função da razão Massa / Carga dos íons é o ESPECTRO DE MASSAS do analito

109 ANÁLISE QUALITATIVA Espectrômetro de Massas Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético. 2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm). 3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons com determinada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento. 4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal elétrico proporcional ao número de íons que incide sobre o elemento.

110 ANÁLISE QUALITATIVA Espectro de Massas m/Z = 118 m/Z = 80 m/Z = 79 - CO - (CO + H) m/Z = m / Z

111 ANÁLISE QUALITATIVA Acoplamento CG - EM Interface cromatógrafo - espectrômetro: CG EM Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo. Câmara de Ionização Coluna Capilar Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.

112 ANÁLISE QUALITATIVA Acoplamento CG - EM Sistema de Controle e Aquisição de Dados: É MANDATÓRIO que sistemas CG-EM sejam totalmente controlados por microcomputador. Sistema de Controle e Aquisição de Dados: 1 Gerencia e monitora o funcionamento dos módulos de CG e EM. 2 Coleta e arquiva espectros de massa em intervalos regulares de tempo e constroi o cromatograma. 3 Após a corrida, compara espectros coletados com bases de dados para identificação dos eluatos. COMPUTADORES RÁPIDOS E COM GRANDE CAPACIDADE DE ESTOCAGEM DE DADOS

113 ANÁLISE QUALITATIVA CG-EM: Geração do Cromatograma Espectros de massas completos coletados e arquivados em intervalos regulares de tempo Geração do cromatograma a partir dos espectros: CROMATOGRAMA DE ÍONS TOTAIS (TIC = To- tal Ion Chromatogram) Para cada espectro o número total de íons detectados na faixa de massas varrida é somado e plotado em função do tempo, gerando o cromatograma. MONITORAMENTO DO ÍON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring) Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentação da espécie de interesse. Gera-se o cromatograma plotando-se o número de íond detectados com a massa desse fragmento em função do tempo. TIC Universal Similar a DIC SIM Seletivo Maior Sensibilidade

114 ANÁLISE QUALITATIVA CG-EM: TIC x SIM Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME TIC Aparecem os picos correspondentes a todas substâncias eluídas SIM (m/z = 149) Cromatograma construido a partir dos mesmos dados acima, mas apenas usando fragementos com massa = 149 (ftalatos: plastificante)

115 ANÁLISE QUALITATIVA Identificação de Eluatos TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS 1 Seleção manual ou automática do espectro de massa correspondente a um eluato. 2 Interpretação manual do espectro e / ou com- paração automática com biblioteca de espectros padrão do equipamento.

116 ANÁLISE QUALITATIVA Identificação de Eluatos Busca automática em bibliotecas de espectros: comparação estatística ( Probability Based Matching ) BIBLIOTECA DE ESPECTROS ESPECTRO DESCONHECIDO PBM Lista com possíveis candidatos + porcentagem de confiabilidade PBM de um eluato desconhecido (1-dodeceno) LIMITAÇÕES: Identificação pouco confiável de es- pectros muito simples Limitada pelo tamanho da base de dados (NIST = espectros) Diferenças entre espectros gerados por diversos EM

117 ANÁLISE QUALITATIVA Emissão Atômica em Plasmas PRINCÍPIO A amostra é fragmentada num plasma, os fragmentos são excitados e emitem luz ao retornarem aos seus estados fundamentais. 1 Amostra é fragmentada ao colidir com moléculas excitadas do gás de suporte do plasma. ABCD + He m A + + B + CD + He + e - 2 Fragmentos são excitados eletronicamente. A + + B + CD + He m A + * + B * + CD * + He 3 Ao retornarem aos seus estados fundamentais os fragmentos excitados emitem luz em comprimentos de onda característicos. A + * A + + h 1 B * B + h 2 CD * CD + h 3 O MONITORAMENTO DA EMISSÃO NOS COMPRIMENTOS DE ONDAS CARACTERÍSTICOS DE CADA FRAGMENTO GERA CROMATOGRAMAS ELEMENTO-ESPECÍFICOS

118 ANÁLISE QUALITATIVA Geração e Sustentação de Plasmas PLASMA Gás ionizado por aplicação de uma descarga elétrica e sustido por um campo elétrico oscilante Eletrons da descarga elétrica colidem com o gás gerando íons Íons formados são acelerados pelo campo elétrico aplicado gerando continuamente mais íons e espécies excitadas Gás de Suporte: HÉLIO (espécies formadas tem energia suficiente para excitar átomos e fragmentos de não metais) Sustentação: MICROONDAS (outros tipos de campos elétricos oscilantes não mantém plasmas estáveis de He a pressão atmosférica de forma conveniente)

119 ANÁLISE QUALITATIVA Espectro de Emissão Atômica Mistura de raias de emissão atômicas e moleculares de frag- mentos do analito e raias de emissão do plasma e impurezas 200 nm 800 nm n-Hexano Fragmentos: C 2 CN OHNH 456 nm 566 nm Fósforo Bromo Cloro Naled (C 4 H 7 Br 2 Cl 2 O 4 P)

120 ANÁLISE QUALITATIVA Esquema Típico de um CG-DEA 1 Cromatógrafo Gasoso 2 Alimentação de Gás de Suporte do Plasma (He) 3 Linha de Transferência (acoplamento CG - DEA) 4 Cavidade Ressonante (geração do plasma) 5 Lente de Focalização 6 Monocromador / Policromador 7 Detector de Luz (fotomultiplicadora / diode array) 8 Amplificação / Digitalização de Sinal 9 Computador

121 ANÁLISE QUALITATIVA DEA: Geração de Plasma Uma cavidade ressonante focaliza potência gerada por uma fonte de microondas no interior de uma cela de detecção por onde passa o gás de suporte. CELA DE DETECÇÃO PLASMA CABO DE ALIMENTAÇÃO DE MICROONDAS CAVIDADE RESSONANTE He Cavidade Ressonante Beenaker TM 010 : Permite plasmas de He estáveis a pressão atmosférica e potências de microondas < 100 W CELA DE DETECÇÃO Tubo de material isolante elétrico e altamente refratário (quartzo, alumina, BN)

122 ANÁLISE QUALITATIVA Interface CG - DEA Plasmas de He se extinguem pela passagem de grandes quantidades de material (~ 1 L de líquido vaporizado) Interface para colunas empacotadas: COLUNA He CELA PURGA VÁLVULA DIVERSORA Antes de ser misturado ao He, o efluente da coluna passa por uma válvula diversora Quando da eluição de grandes quantidades de analito o fluxo da coluna é desviado para a purga Colunas capilares: não há necessidade de diversão.


Carregar ppt "Petruccio Tenório Medeiros. CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google