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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Torque teno vírus (TTV) Thais Fumaco.

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Torque teno vírus (TTV) Thais Fumaco Teixeira (Exame de qualificação)

2 Histórico 1997: Torque teno vírus (TTV) Paciente com hepatite pós-transfusional de etiologia desconhecida Iniciais do nome do paciente (T.T.) transfusion transmitted virus

3 Histórico 2000: TTV-like mini virus (TLMV) 2005: Novo significado para TTV e TLMV Torque teno vírus (TTV) Torque teno mini vírus (TTMV) Torque = colar teno = pequeno

4 Histórico 2007: Torque teno midi-vírus (TTMDV) Vírus relacionado ao TTV Tamanho intermediário

5 Histórico Infecção por TTV não é restrita a humanos Chimpanzés Tupaias Suínos Bovinos Cães Gatos Leões marinhos

6 Taxonomia Família Anelloviridae Gênero Anellovirus Sub-classificados em genogrupos

7 Taxonomia

8 Características moleculares DNA circular Fita simples Polaridade negativa Variabilidade no tamanho TTV humano (3,4 kb – 3,9 kb) TTMDV (3,2 kb) TTMV (2,8 kb – 2,9 kb) TTSuV (2,9 kb) TTV felino (2,1 kb)

9 Epidemiologia Amplamente difundidos Distribuição não está associada com a sua origem geográfica Prevalência TTSuV1 varia de 24% a 100% Prevalência de TTSuV2 na Espanha (77%)

10 Epidemiologia TTV estaria associado a diferentes patologias auto-imunes: Doenças reumáticas Patologias hepáticas Disturbios respiratórios Não existem dados definitivos indicando que TTV é responsável por qualquer doença em humanos Vírus órfão

11 Epidemiologia Em suínos: TTSuV infecta uma elevada proporção de animais aparentemente saudáveis Co-infecção com outros patógenos Prevalência de TTSuV2 em suínos com SMDS (91%) e em suínos saudáveis (72%) (Kekarainen et al., 2006) TTSuV1 facilita indução da SMDS pelo PCV2 (Ellis et al., 2008)

12 Patogenia DNA de TTV tem sido identificado em: Células mononucleares de sangue periférico; Células hematopoiéticas da medula óssea; Plasma; Fezes; Saliva; Suabes nasais e de garganta. Aparentemente necessita de células em multiplicação ativa para se replicar

13 Transmissão Principal transmissão TTSuV: oral-fecal (soro, plasma, fezes) Transmissão vertical: colostro, útero, soro de porcas e seus natimortos Sêmen Trato respiratório: pulmões, secreções nasais e saliva

14 Detecção de Torque teno vírus suíno 1 (TTSuV1) em diferentes tecidos de suínos

15 Introdução Aparentemente TTSuV não tem associação com qualquer patologia Estudo mostrou uma aparente associação negativa entre a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS (Teixeira et al., 2008) Estudo de distribuição de TTSuV em tecidos detectou uma maior prevalência de TTSuV no pulmão (Bigarré et al., 2005)

16 Introdução Replicação do TTSuV não parece estar restrita a este órgão Formas replicativas intermediárias de fita dupla de TTV foram encontradas: Fígado Células da medula óssea Pulmão Pâncreas Baço Outros tecidos linfóides

17 Objetivos Detecção de TTSuV em órgãos de suínos com e sem a Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos;

18 Material e Métodos Amostras Órgãos de suínos (pulmão, fígado, rim, baço e linfonodo) 11 suínos saudáveis 76 suínos com SMDS Extração de DNA Quantificação (100 ng) PCR

19 Material e Métodos Sensibilidade da PCR Produto da PCR de TTSuV1 (349 pb) e TTSuV2 (572 pb) clonado no vetor pCR2.1; Sequenciamento; Plasmídeo: C+1 e C+2; DNA plasmidial foi quantificado; Diluição seriada na base 10.

20 Material e Métodos Construção do controle interno Mesmos primers usados na PCR para TTSuV1 e 2; PCR com temperatura de anelamento de 40 °C; TTSuV1: célula de linhagem de rim de suíno (SK6); Produto de 293 pb foi clonado e sequenciado; Plasmídeo: CI1; TTSuV2: célula de linhagem de rim de suíno livre de PCV1 (PKsC3); Produto de 441 pb foi clonado e sequenciado; Plasmídeo: CI2; DNA plasmidial foi quantificado; Diluição seriada na base 10.

21 Resultados bp 400 bp 349 bp 293 bp bp 572 bp 441 bp A) B) Figura1. A) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV1 B) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV2

22 Resultados Tabela 1. Prevalência de TTSuV1 e 2 em tecidos de suínos saudáveis e com Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Com um tecido positivo o animal foi considerado positivo para TTSuV. Suínos saudáveis (n=11) Suínos com SMDS (n=76) Total (n=87) 100 (11/11) 48.7 (37 /76) (48/87) 100 (11/11) 94.7 (72 /76) 93.1 (81/87) % de suínos positivos para sTTV1 % de suínos positivos para sTTV2

23 Resultados Tabela 2. Prevalência de TTSuV1 e 2 em 5 diferentes amostras de tecidos de suínos saudáveis e com a Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Suínos saudáveis Grupos Órgãos Pulmão Fígado Rim Baço Linfonodo 100% (11/11) 90.9% (10/11) 100% (11/11) TTSuV1 TTSuV2 TTSuV1 TTSuV2 Suínos com SMDS 37.7% (26/69) 41.9% (31/74) 37.8% (28/74) 38.5% (27/70) 30.4% (21/69) 76.8% (53/69) 81.1% (60/74) 59.4% (44/74) 77.1% (54/70) 68.1% (47/69) 81.8% (9/11) 100% (11/11) 81.8% (9/11) 90.9% (10/11)

24 Resultados Figura 2. árvore filogenética baseada na sequência de nucleotídeos da região não traduzida do genoma do TTSuV. Número de acesso do GenBank das sequências de referência para TTSuV1 (AB e AY823990) e TTSuV2 (AY823991).

25 Discussão Bigarré et al. (2005) relatou que o TTSuV foi encontrado mais frequentemente no pulmão. (11,2% pulmão; 8,1% linfonodo inguinal; 5,6% linfonodo mesentérico; 4,4% tonsila; 3,1% ileo) Difere dos resultados encontrados por Ellis et al. (2008) e Kekarainen et al.(2006).

26 Conclusão Trabalho mostra que a distribuição de TTSuV1 em tecidos aparentemente não apresenta em particular um órgão alvo. Resultados reforçam uma aparente correlação inversa entre a presença de TTSuV1 e o desenvolvimento da SMDS. Corrobora com trabalho prévio realizado por nossa equipe.

27 Torque teno vírus suíno (TTSuV) em cultivos celulares e tripsina

28 Introdução Interação entre TTSuV e PCV2 Sistema eficaz de replicação para o TTSuV Nenhum cultivo que permita a propagação de TTSuV foi identificado Nenhum cultivo foi avaliado em busca de TTSuV como contaminante

29 Objetivos Detectar a presença de genomas de TTSuV em células de linhagem, soro e tripsina

30 Material e Métodos Amostras 25 células de linhagem 10 células em cultivo 15 ampoladas e estocadas em nitrogênio líquido 9 lotes de soros (diferentes fornecedores) Soro fetal bovino Soro de equíno Soro de ovino Soro de terneiro 5 lotes de tripsina

31 Material e Métodos Extração de DNA Quantificação (100 ng) PCR forward-1: 5 GGG AGC TCA AGT CCT CAT TTG 3 forward-2: 5 GGG CCW GAA GTC CTC ATT AG 3 reverso: 5 GCG GCA TAA ACT CAG CCA TTC 3 (Rijsewijk,2008) TTSuV1: 106 pb TTSuV2: 103 pb

32 Material e Métodos Todos os produtos de PCR foram clonados e sequenciados Sequências obtidas foram depositadas no GenBank n° de acesso (GU A GU574729) Análise filogenética

33 Resultados Células de linhagem Presença de DNA viral de TTSuV1 Presença de DNA viral de TTSuV2 Baby hamster kidney (BHK-21)-+ Chicken embryo related (CER)-+ Crandell feline kidney (CRFK)-+ Human embryonic intestine (H407)+- Human leukemic cell (K562) (28/05/04) * +- African green monkey kidney embryonic (MA-104) (28/04/93) * +- Madin-darby bovine kidney (MDBK) (17/08/01) * +- Madin-darby canine kidney (MDCK) (25/10/05) * +- Porcine kidney PK(15)++ Porcine kidney (PK-2a)-+ Porcine kidney sub-clone 3 PCV1 free (PKsC3)++ Swine kidney (SK6)-+ Swine testicle (ST)++ Bovine thyroid cell (TB) (27/02/85) * +- African green monkey kidney (Vero)-+

34 Resultados Células de linhagem Presença de DNA viral de TTSuV1 Presença de DNA viral de TTSuV2 Canine Carcinoma (A-72) (2/07/08)*-- Mutant MDBK Resistant to BVDV Infection (CRIB) (16/01/06)*-- Embryonic Bovine Trachea (EBTr) (29/12/04)*-- Equine Dermis (ED) (9/07/08)*-- Foetal Lamb Kidney (FLK) (6/12/90)*-- Murine Fibrosarcoma (L929) (3/06/08)*-- Monkey Kidney (LLC-MK 2 ) (15/07/86)*-- Murine Neuroblastoma (N2A) (18/10/04)*-- Rabbit Kidney (RK13) (13/01/93)*-- Murine myeloma (SP2/O-Ag14)--

35 Resultados Soro e tripsina Presença de DNA viral de sTTV1 Presença de DNA viral de sTTV2 Fetal Bovine Serum (supplier A)-- Fetal Bovine Serum (supplier B)-- Fetal Bovine Serum (supplier C)-- Calf Serum (treated in house with polyethylene glycol)-- Horse serum (inactivated)-- Horse serum (1 donor)-- Horse serum (pool)-- Ovine serum-- Calf serum-- Trypsin (supplier A)++ Trypsin (supplier B)-- Trypsin (supplier C)-- Trypsin (supplier D)-- Trypsin (supplier E)--

36 Resultados Fig. 1. Árvore filogenética baseada nas sequências de nucleotídeos da região não codificante do genoma dos sTTVs. AB e AY são as sequências de referência para sTTV1 e AY é a sequência referência para sTTV2.

37 Discussão Devido a natureza ubíqua do TTSuV fontes comuns de transmissão devem existir (McKeown et al., 2004) Vacinas preparadas em células contaminadas Kekarainen et al. (2009) relataram presença de TTSuV1 e 2 em enzimas e vacinas. Segales et al. (2009) também detectaram TTSuV1 e 2 em soro de suínos desde 1985.

38 Conclusão Primeira evidência de TTSuV como contaminante celular. Resultados sugerem que a fonte da contaminação pode ter sido a tripsina. Contaminação existente no laboratório desde 1985 (Tireóide bovina-TB).

39 Obrigada ! Thais Fumaco Teixeira Doutoranda PPGCV


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