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UNIÃO DA TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DENTRO DO NÚCLEO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells Francisco.

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1 UNIÃO DA TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DENTRO DO NÚCLEO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells Francisco J. Iborra, Dean A. Jackson, Peter R. Cook Science vol 293, 1139-1142 Agosto 2001

2 Introdução Procariotos X Eucariotos RNA pol DNA mRNA mRNA degradado Tradução Ribossomo Ribossomos Citoplasma Transporte Núcleo Transcrição mRNA maduro

3 Introdução A membrana nuclear é a característica que define os eucariotos. Ela divide a célula em dois compartimentos e assume-se que a tradução está restrita somente a um deles - o citoplasma. A idéia seria EVITAR a tradução antes do splicing.

4 Introdução Três evidências para que ocorra tradução no núcleo: 1. Núcleo contém componentes necessários, mas estes podem não estar ativos;

5 Introdução 2. Experimentos pouco controlados levam a acreditar que núcleos podem aminoacilar tRNAs e incorporar aminoácidos radioativos em proteínas. Suspeita de contaminação Núcleo Citoplasma Proteínas Migração

6 Introdução 3. Degradação dos transcritos que possuem stop códons prematuros (fenômeno conhecido como nonsense-mediated decay - NMD). UAA Stop códon prematuro Degradação mRNA

7 Introdução Como pode a única maquinaria capaz de reconhecer um stop códon - um ribossomo citoplasmático ativo - disparar a degradação de um transcrito que ainda está no núcleo?

8 Metodologia antiga de localização de sítios de tradução no núcleo: [ 3 H ] leucina tRNA leu - [ 3 H ] leucina. Proteína Desvantagem: tempo de incubação longo para a conversão da [ 3 H ] leucina o que dá tempo à proteína recém sintetizada de entrar no núcleo. Metodologia Antiga Conversão Síntese

9 Metodologia Atual Um sistema de tradução in vitro que utilizasse temperatura baixa e concentrações subótimas de precursores, de modo que poucas proteínas, que continham em média 350 resíduos de aminoácidos, fossem completadas durante a reação e estivessem aptas a escapar dos sítios de síntese.

10 Metodologia Atual Materiais a serem utilizados: HCO 3- ATP Na + Mg 2+ K+K+ [ 3 H ] leu 19 aa Aminoacil tRNA sintetases GTP

11 Metodologia Atual Condições do experimento: Incubação a baixas temperaturas, 27.5 o Curto tempo, 3 minutos Consequentemente, poucas proteínas seriam completadas durante a incubação. Somente 15 resíduos seriam polimerizados. Tamanho médio das proteínas seria de ~350aa.

12 Padronização do sistema Verificação do efeito de inibidores na incorporação de [ 3 H ] lisina durante a síntese de proteínas. 9%9%

13 Padronização do sistema A mesma verificação foi feita ao se incorporar [ 35 S] Met durante a síntese protéica. Produtos marcados tinham o tamanho esperado de uma população de polipeptídeos recém-sintetizados normais.

14 Padronização do sistema Para garantir, verificaram que a incorporação de [ 3 H] Leu na presença de biotina- lisina-tRNA não inibia a síntese de proteínas. Além disso, viram que a biotina era melhor imunolocalizador que os precursores radioativos.

15 Imunolocalização da biotina A imunolocalização de polipeptídeos recém- sintetizados com biotina é complicada pela existência de biotina endógena. Esta é encontrada solúvel e/ou covalentemente ligada a carboxilases na matriz mitocondrial. A biotina solúvel foi extraída utilizando-se tRNAs carregados. E a biotina covalentemente ligada foi imunomarcada.

16 Imunolocalização da biotina Biotina nas mitocôndrias foi prontamente detectada, mas a dos núcleos não. Núcleo e citoplasma mais marcados após incubação com biotina-lisina-tRNA. A marcação nuclear está concentrada em sítios discretos. Controle com cicloheximida reduziu a marcação porque inibe a síntese protéica.

17 Alguns peptídeos com biotina poderiam ter sido feitos no citoplasma e importados para dentro do núcleo, mas marcação similar foi obtida com núcleos isolados desprovidos de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos. Imunolocalização da biotina Célula X Núcleo

18 Imunolocalização da biotina Nenhum sinal mitocondrial foi visto do lado de fora dos núcleos, confirmando que a maior parte do citoplasma havia sido removida. A remoção de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos não afetou a intensidade nuclear.

19 Imunolocalização da biotina A periferia nuclear não foi marcada, por isso, a síntese de proteínas na membrana nuclear externa seguida por importação não foi a responsável pela marcação interna. A mesma intensidade nucleoplasmática foi obtida em amostras de células e núcleos isolados.

20 Imunolocalização da biotina Núcleo Células 0 0 50 25 4080 Intensidade ( unidade arbitrária) Número

21 Para provar que ribossomos citoplasmáticos não eram os responsáveis pela marcação do núcleo, foi utilizada a droga thapsigargin (bloqueador de importação nuclear). Imunolocalização da biotina Núcleo + thapsigargin Proteínas > 40KDa

22 Imunolocalização da biotina Mesmo que os ribossomos citoplasmáticos tivessem entrado, eles não poderiam iniciar a tradução porque foi adicionado ATA (ácido aurintricarboxílico). Este inibe o início da tradução sem afetar a marcação do nucleoplasma. Todos estes controles serviram para confirmar que a tradução citoplasmática não poderia ser considerada na marcação nuclear.

23 BODIPY-lisina-tRNA Resultados similares foram obtidos com BODIPY-lisina -tRNA que também marca proteínas recém-sintetizadas em reações de tradução. BODIPY-lisina -tRNA não tem o imprevisto da biotina, pois não é um composto endógeno.

24 BODIPY-lisina-tRNA Células permeabilizadas Células permeabilizadas + cicloheximida

25 O sinal nucleoplasmático constitui 14% do total. A marcação citoplasmática foi cerca de 5 vezes mais forte que a nuclear. BODIPY-lisina-tRNA mRNA Núcleo Citoplasma

26 A marcação com biotina-lisina-tRNA e BODIPY-lisina-tRNA, que foi detectada com métodos diferentes, deram resultados similares. Biotina X BODIPY-lisina-tRNA

27 Biotina-lisina-tRNA BODIPY-lisina-tRNA 100% 15%

28 Immunogold Posteriormente, células permeabilizadas e incubadas com biotina-lisina-tRNA foram marcadas com Immunogold confirmando que o interior nuclear continha cerca de 10% dos peptídeos recém-sintetizados da célula.

29 Immunogold Núcleo Citoplasma

30 Immunogold Hipótese: - Se toda a tradução ocorresse no citoplasma, proteínas recém-sintetizadas entrariam e se difundiriam por todo o núcleo; mas, se alguma tradução estivesse unida à transcrição alguns peptídeos nascentes teriam que ser encontrados juntamente com transcritos nascentes.

31 Immunogold Polipeptídeos recém-sintetizados e RNA foram estendidos na presença de biotina- lisina-tRNA e Br-UTP e também marcados comImmunogold. Os dois foram, muitas vezes, encontrados juntos.

32 Resultado final Mostrou-se que : - lisina ligada a três diferentes marcadores - 3 H, biotina e BODIPY - é incorporada dentro de sítios discretos no núcleo e que alguma desta tradução nuclear depende de transcrição simultânea pela RNA polimerase II.

33 Modelo A partir deste resultado combinado ao resultado obtido no NMD propõe-se o seguinte modelo: - Ribossomos são montados dentro do nucléolo e exportados para ambos nucleoplasma e citoplasma, onde eles se associarão com transcritos e se tornarão ativos; - Exportação não precisa ser seletiva, talvez 10 vezes mais ribossomos terminem ativos no citoplasma, enquanto o nucleoplasma está junto à cromatina.

34 - Alguns ribossomos nucleares estão incorporados dentro dos sítios de transcrição do nucleoplasma que contêm muitas polimerases ativas e unidades de transcrição. - Estes ribossomos corrigem transcritos recém-sintetizados enquanto eles emergem de polimerases. Modelo

35 - Qualquer ribossomo acoplado detecta stop códons incorretamente posicionados, ativando a degradação destes transcritos; simultaneamente polipeptídeos truncados e indesejáveis são degradados por proteasomas. - Se nenhum stop códon prematuro for encontrado, o transcrito deverá ser exportado para o citoplasma onde sofrerá múltiplas iniciações. Modelo

36 Conclusão Geral Isto leva a crer que os precursores de transcrição e tradução eucarióticos estão unidos, tanto quanto em procariotos.


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