Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells

Apresentação em tema: "Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells"— Transcrição da apresentação:

1 UNIÃO DA TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DENTRO DO NÚCLEO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells Francisco J. Iborra, Dean A. Jackson, Peter R. Cook Science vol 293, Agosto 2001

2 Procariotos X Eucariotos
Introdução Procariotos X Eucariotos RNA pol RNA pol DNA DNA mRNA Transcrição Transcrição mRNA Ribossomos Citoplasma Núcleo Transporte Citoplasma mRNA maduro mRNA degradado Citoplasma Tradução Ribossomo Tradução

3 A membrana nuclear é a característica que define os eucariotos.
Introdução A membrana nuclear é a característica que define os eucariotos.  Ela divide a célula em dois compartimentos e assume-se que a tradução está restrita somente a um deles - o citoplasma.  A idéia seria EVITAR a tradução antes do splicing.

4  Três evidências para que ocorra tradução no núcleo:
Introdução  Três evidências para que ocorra tradução no núcleo: 1. Núcleo contém componentes necessários, mas estes podem não estar ativos;

5 Suspeita de contaminação
Introdução 2. Experimentos “pouco” controlados levam a acreditar que núcleos podem aminoacilar tRNAs e incorporar aminoácidos radioativos em proteínas. Suspeita de contaminação Migração Proteínas Citoplasma Núcleo

6 Introdução 3. Degradação dos transcritos que possuem stop códons prematuros (fenômeno conhecido como “nonsense-mediated decay” - NMD). Stop códon prematuro Degradação UAA mRNA mRNA

7 Introdução  Como pode a única maquinaria capaz de reconhecer um stop códon - um ribossomo citoplasmático ativo - disparar a degradação de um transcrito que ainda está no núcleo?

8  Metodologia antiga de localização de sítios de tradução no núcleo:
[ 3H ] leucina tRNAleu - [ 3H ] leucina Proteína  Desvantagem: tempo de incubação longo para a conversão da [ 3H ] leucina o que dá tempo à proteína recém sintetizada de entrar no núcleo. Conversão Síntese

9 Metodologia Atual  Um sistema de tradução in vitro que utilizasse temperatura baixa e concentrações subótimas de precursores, de modo que poucas proteínas, que continham em média 350 resíduos de aminoácidos, fossem completadas durante a reação e estivessem aptas a escapar dos sítios de síntese.

10  Materiais a serem utilizados:
Metodologia Atual  Materiais a serem utilizados: Mg2+ [ 3H ] leu HCO3- GTP K+ ATP Na+ Aminoacil tRNA sintetases 19 aa

11  Condições do experimento:  Incubação a baixas temperaturas, 27.5o
Metodologia Atual  Condições do experimento:  Incubação a baixas temperaturas, 27.5o  Curto tempo, 3 minutos  Consequentemente, poucas proteínas seriam completadas durante a incubação.  Somente 15 resíduos seriam polimerizados.  Tamanho médio das proteínas seria de ~350aa.

12 Padronização do sistema
 Verificação do efeito de inibidores na incorporação de [ 3H ] lisina durante a síntese de proteínas. 9%

13 Padronização do sistema
 A mesma verificação foi feita ao se incorporar [35S] Met durante a síntese protéica.  Produtos marcados tinham o tamanho esperado de uma população de polipeptídeos recém-sintetizados normais.

14 Padronização do sistema
 Para garantir, verificaram que a incorporação de [3H] Leu na presença de biotina-lisina-tRNA não inibia a síntese de proteínas.  Além disso, viram que a biotina era melhor imunolocalizador que os precursores radioativos.

15 Imunolocalização da biotina
A imunolocalização de polipeptídeos recém-sintetizados com biotina é complicada pela existência de biotina endógena.  Esta é encontrada solúvel e/ou covalentemente ligada a carboxilases na matriz mitocondrial.  A biotina solúvel foi extraída utilizando-se tRNAs carregados. E a biotina covalentemente ligada foi imunomarcada.

16 Imunolocalização da biotina
Biotina nas mitocôndrias foi prontamente detectada, mas a dos núcleos não. Núcleo e citoplasma mais marcados após incubação com biotina-lisina-tRNA. A marcação nuclear está concentrada em sítios discretos. Controle com cicloheximida reduziu a marcação porque inibe a síntese protéica.

17 Imunolocalização da biotina
 Alguns peptídeos com biotina poderiam ter sido feitos no citoplasma e importados para dentro do núcleo, mas marcação similar foi obtida com núcleos isolados desprovidos de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos. Célula X Núcleo

18 Imunolocalização da biotina
 Nenhum sinal mitocondrial foi visto do lado de fora dos núcleos, confirmando que a maior parte do citoplasma havia sido removida.  A remoção de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos não afetou a intensidade nuclear.

19 Imunolocalização da biotina
A periferia nuclear não foi marcada, por isso, a síntese de proteínas na membrana nuclear externa seguida por importação não foi a responsável pela marcação interna.  A mesma intensidade nucleoplasmática foi obtida em amostras de células e núcleos isolados.

20 Intensidade ( unidade arbitrária)
Imunolocalização da biotina Núcleo Células 50 25 40 80 Intensidade ( unidade arbitrária) Número

21 Imunolocalização da biotina
 Para provar que ribossomos citoplasmáticos não eram os responsáveis pela marcação do núcleo, foi utilizada a droga “thapsigargin” (bloqueador de importação nuclear). Proteínas > 40KDa Núcleo + thapsigargin

22 Imunolocalização da biotina
 Mesmo que os ribossomos citoplasmáticos tivessem entrado, eles não poderiam iniciar a tradução porque foi adicionado ATA (ácido aurintricarboxílico). Este inibe o início da tradução sem afetar a marcação do nucleoplasma.  Todos estes controles serviram para confirmar que a tradução citoplasmática não poderia ser considerada na marcação nuclear.

23 BODIPY-lisina-tRNA  Resultados similares foram obtidos com BODIPY-lisina -tRNA que também marca proteínas recém-sintetizadas em reações de tradução.  BODIPY-lisina -tRNA não tem o imprevisto da biotina, pois não é um composto endógeno.

24 BODIPY-lisina-tRNA Células permeabilizadas Células permeabilizadas + cicloheximida

25 O sinal nucleoplasmático constitui 14% do total.
BODIPY-lisina-tRNA O sinal nucleoplasmático constitui 14% do total. A marcação citoplasmática foi cerca de 5 vezes mais forte que a nuclear. Núcleo mRNA Citoplasma mRNA

26 Biotina X BODIPY-lisina-tRNA
 A marcação com biotina-lisina-tRNA e BODIPY-lisina-tRNA, que foi detectada com métodos diferentes, deram resultados similares.

27 Biotina X BODIPY-lisina-tRNA
100% Biotina-lisina-tRNA 15% BODIPY-lisina-tRNA

28 Immunogold  Posteriormente, células permeabilizadas e incubadas com biotina-lisina-tRNA foram marcadas com “Immunogold” confirmando que o interior nuclear continha cerca de 10% dos peptídeos recém-sintetizados da célula.

29 Immunogold Citoplasma Núcleo

30 Immunogold  Hipótese: - Se toda a tradução ocorresse no citoplasma, proteínas recém-sintetizadas entrariam e se difundiriam por todo o núcleo; mas, se alguma tradução estivesse unida à transcrição alguns peptídeos nascentes teriam que ser encontrados juntamente com transcritos nascentes.

31 Immunogold  Polipeptídeos recém-sintetizados e RNA foram estendidos na presença de biotina-lisina-tRNA e Br-UTP e também marcados com “Immunogold”. Os dois foram, muitas vezes, encontrados juntos.

32 Resultado final  Mostrou-se que : - lisina ligada a três diferentes marcadores - 3H, biotina e BODIPY - é incorporada dentro de sítios discretos no núcleo e que alguma desta tradução nuclear depende de transcrição simultânea pela RNA polimerase II.

33 Modelo  A partir deste resultado combinado ao resultado obtido no NMD propõe-se o seguinte modelo: - Ribossomos são montados dentro do nucléolo e exportados para ambos nucleoplasma e citoplasma, onde eles se associarão com transcritos e se tornarão ativos; - Exportação não precisa ser seletiva, talvez 10 vezes mais ribossomos terminem ativos no citoplasma, enquanto o nucleoplasma está junto à cromatina.

34 Modelo - Alguns ribossomos nucleares estão incorporados dentro dos sítios de transcrição do nucleoplasma que contêm muitas polimerases ativas e unidades de transcrição. - Estes ribossomos “corrigem” transcritos recém-sintetizados enquanto eles emergem de polimerases.

35 Modelo - Qualquer ribossomo acoplado detecta stop códons incorretamente posicionados, ativando a degradação destes transcritos; simultaneamente polipeptídeos truncados e indesejáveis são degradados por proteasomas. - Se nenhum stop códon prematuro for encontrado, o transcrito deverá ser exportado para o citoplasma onde sofrerá múltiplas iniciações.

36 Conclusão Geral Isto leva a crer que os precursores de transcrição e tradução eucarióticos estão unidos, tanto quanto em procariotos.