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From the Chromosomal Loops and the Scaffold to the Classic Bands of the Metaphase Chromosomes Y. Saitoh & U. K. Laemmli Cold Spring Harbor Symposia on.

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1 From the Chromosomal Loops and the Scaffold to the Classic Bands of the Metaphase Chromosomes Y. Saitoh & U. K. Laemmli Cold Spring Harbor Symposia on Quantititive Biology Vol 83, 1993

2 Loops da Cromatina O estudo da estrutura dos cromossomos: O estudo da estrutura dos cromossomos: Microscopia ótica: muito grosseira Microscopia ótica: muito grosseira Microscopia eletrônica: muito detalhada Microscopia eletrônica: muito detalhada Métodos bioquímicos: interferências destrutivas Métodos bioquímicos: interferências destrutivas Em seu estado original, os cromossomos aparentam ser apenas estruturas cilíndricas, preenchidos homogeneamente com fibras nucleoprotéicas Em seu estado original, os cromossomos aparentam ser apenas estruturas cilíndricas, preenchidos homogeneamente com fibras nucleoprotéicas

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4 Loops da Cromatina A noção de que ocorrem loops na cromatina a cada 100 Kb em média, é solida. A noção de que ocorrem loops na cromatina a cada 100 Kb em média, é solida. Esta organização foi descoberta em cromossomos metafásicos sem histonas e outras proteínas, que foram removidas com poliânions de sulfato de dextran e heparina; com intuito de desenovela-los. Esta organização foi descoberta em cromossomos metafásicos sem histonas e outras proteínas, que foram removidas com poliânions de sulfato de dextran e heparina; com intuito de desenovela-los.

5 Loops da Cromatina Os princípios da organização em loops foram comprovados com técnicas de: Os princípios da organização em loops foram comprovados com técnicas de: Seções cromossômicas finas Seções cromossômicas finas Espalhamento dos cromossomos Espalhamento dos cromossomos Imunoflorescência com anticorpos contra Topoisomerase II Imunoflorescência com anticorpos contra Topoisomerase II

6 Proteínas formam uma armação ou scaffold Alças de DNA são ligadas pela base SAR = scaffold attachment region DNA rico em AT com sítios para Topo II

7 Loops da Cromatina Em cromossomos distendidos por exposição a baixas concentrações de sal ou pela retirada parcial de H1, os loops são observados como halos periféricos, devido a: Em cromossomos distendidos por exposição a baixas concentrações de sal ou pela retirada parcial de H1, os loops são observados como halos periféricos, devido a: Distensão das fibras da cromatina Distensão das fibras da cromatina Desespiralização longitudinal das bases que compõe o loop Desespiralização longitudinal das bases que compõe o loop

8 Loops da Cromatina A base dos loops de cromossomos nativos é uma região longitudinal e hetrocromática denominada de scaffold. A base dos loops de cromossomos nativos é uma região longitudinal e hetrocromática denominada de scaffold. Com base no modelo Loop / Scaffold poderiam ser identificadas proteínas específicas do scaffold e de regiões associadas a ele, como as SARs. Com base no modelo Loop / Scaffold poderiam ser identificadas proteínas específicas do scaffold e de regiões associadas a ele, como as SARs.

9 Topoisomerase II e SARs A SC1 (scaffold 1)é a principal proteína do scaffold e foi identificada como uma topoisomerase II. A SC1 (scaffold 1)é a principal proteína do scaffold e foi identificada como uma topoisomerase II. Essa proteína se liga seletivamente as SARs e está envolvida com o final da condensação cromossômica Essa proteína se liga seletivamente as SARs e está envolvida com o final da condensação cromossômica

10 Topoisomerase II e SARs As SRAs são os possíveis constituintes da base dos loops da cromatina e são regiões ricas em AT (cerca de 65 %). As SRAs são os possíveis constituintes da base dos loops da cromatina e são regiões ricas em AT (cerca de 65 %). Proteínas que se ligam seletivamente as SRAs: Proteínas que se ligam seletivamente as SRAs: Histona H1 Histona H1 HMG I Y - High Mobility Protein HMG I Y - High Mobility Protein ARBD ARBD

11 Bandas Cromossômicas São variações na estrutura longitudinal das cromátides que são reveladas por várias técnicas de coloração. São variações na estrutura longitudinal das cromátides que são reveladas por várias técnicas de coloração. Classicamente os cromossomos parecem ser construidos por discos empilhados, e cada disco difere de seu vizinho por: Classicamente os cromossomos parecem ser construidos por discos empilhados, e cada disco difere de seu vizinho por: Densidade gênica Densidade gênica Tempo de replicação Tempo de replicação Composição de bases Composição de bases Conteúdo de sequências repetitivas Conteúdo de sequências repetitivas Conformação da cromatina Conformação da cromatina

12 Bandas Cromossômicas Os principais padrões de bandamento cromossômico são: Os principais padrões de bandamento cromossômico são: Banda C - Heterocromatina centromérica, contendo DNA satélite e praticamente nenhum gene Banda C - Heterocromatina centromérica, contendo DNA satélite e praticamente nenhum gene Banda G - Composta por bandas de hetrocromatina facultativa, de repilcação tardia e são ricas em AT Banda G - Composta por bandas de hetrocromatina facultativa, de repilcação tardia e são ricas em AT Banda Q - Feita com quinacrina, cora também regioes ricas em AT, revelando um padrão semelhante as bandas C. Banda Q - Feita com quinacrina, cora também regioes ricas em AT, revelando um padrão semelhante as bandas C.

13 Esquerda: Padrão de bandamento G de alta resolução em prometáfase do cromossomo 1 (Muntjac) Direita:

14 Bandas Cromossômicas Apenas 20% dos genes humanos mapeados encontram-se em regiões de banda Q e G; e em sua maioria são housekeeping. Apenas 20% dos genes humanos mapeados encontram-se em regiões de banda Q e G; e em sua maioria são housekeeping. A heterocromatina facultativa corada pela banda Q é responsável pelo silenciamento de genes tecido-específicos. A heterocromatina facultativa corada pela banda Q é responsável pelo silenciamento de genes tecido-específicos.

15 Bandas Cromossômicas As bandas R possuem um padrão reverso ao encontrado nas bandas Q e G, coram regiões ricas em GC e se replicam na fase S. As bandas R possuem um padrão reverso ao encontrado nas bandas Q e G, coram regiões ricas em GC e se replicam na fase S. A maioria dos genes selvagens expressos estão localizados em bandas R. A maioria dos genes selvagens expressos estão localizados em bandas R. As bandas G / Q são cerca de 3.2 % mais ricas em AT do que as bandas R. Esta pequena diferença nao poderia explicar os padrões de fluorescência com daunomicina. Assim, a única opção seria uma alta organização cromossômica. As bandas G / Q são cerca de 3.2 % mais ricas em AT do que as bandas R. Esta pequena diferença nao poderia explicar os padrões de fluorescência com daunomicina. Assim, a única opção seria uma alta organização cromossômica.

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17 Durante a corrida não se vêem as equipes

18 Última volta sprintador da equipe é conduzido

19 Modelo de Loops/Scaffold de Cromossomos Nativos

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21 Bandas Q e R

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24 Empacotamento dos Loops Cromossômicos:

25 Detecção da Base dos Loops

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27 Detecção do Corpo dos Loops

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29 Topoisomerase II e SARs

30 Bandas Q e R são geradas por Folding Diferencial e AT-Queue

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33 Complementaridade nas Sub- bandas: Cada

34 a) Esquema de protocolos de coloração seletiva para a base ou corpo dos loops da cromatina b)

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36 a - O cromossomo 1 é corado em vermelho b -

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