CICLO CELULAR.

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1 CICLO CELULAR

2 CROMOSSOMOS

3 COMPACTAÇÃO DA CROMATINA

4 NÍVEIS DE COMPACTAÇÃO DA CROMATINA
1ª: NUCLEOSSOMA - octâmero de histonas H2A, H2B, H3 e H4. H1. Redução no tamanho DNA entre 6 a 7 vezes. 2ª: SOLENÓIDE- 6 nucleossomos. 3ª :ALÇAS - solenóide- alças unidas - proteínas não-histônicas (cromômeros). 4ª CROMOSSOMOS- enrolamento final.

5 1º NÍVEL: NUCLEOSSOMO

6 SOLENÓIDE

7 SOLENÓIDE

8 COMPRIMENTO DO CROMOSSOMO 1
DNA 15cm NUCLEOSSOMA 1,5cm (1:10)~ 200pb SOLENÓIDE 0,3cm (1:50)~1200pb 10a 100kb PRÓFASE 50m (1:3000) METÁFASE 15m (1:10000) BANDA 10 a 20 milhões pb

9 PRINCIPAIS CONSTITUINTES CROMOSSÔMICOS
Elementos Fundamentais de um Cromossomo: Origens de Replicação; Um centrômero; Telômeros;

10 ORIGENS DE REPLICAÇÃO DO DNA
Cada cromossomos é replicado pelo início simultâneo da replicação em regiões múltiplas dentro do cromossomo Réplicons. O processo replicação é controlado cada cromossomo será replicado totalmente apenas uma vez na fase S

11 CENTRÔMEROS Constrição Primária seqüências DNA repetitivas + proteínas ( CENP-B). Cópias seqüências múltiplas com 171 pb = DNA alfa. Classificação da forma cromossomo. Sítio de ligação das cromátides irmãs.

12 CENTRÔMERO

13 CENTRÔMERO Formação cinetócoro= complexo DNA+ proteínas, durante a prófase. Cinetócoro- interação complexa; - microtúbulos;

14 CENTRÔMERO

15 CLASSIFICAÇÃO CROMOSSÔMICA

16 TELÔMEROS Telômeros extremidades cromossômicas; DNA + proteínas, seqüências repetidas (TTAGGG)n Função : Integridade cromossômica; estabilidade; evitam a degradação dos cromossomos (nucleases); replicação correta dos telômeros (telomerase). Telomerase presente células embrionárias e germinativas; células somáticas parecem ter telomerase inativa morte celular por encurtamento telômero antes de ocorrer alteração cromossômica. Redução : associação ponta a ponta; quebras ; translocações. Telomerase ativa célula somática poderá indicar condição neoplásica.

17 SATÉLITES Cromossomos Acrocêntricos: 13, 14, 15, 21 e 22.
Ligado ao braço curto: Constrição secundária. Sítio formação ribossomo (genes RNAr) Regiões organizadoras nucleolares (RON/NOR)

18 TIPOS DE CROMATINA Eucromatina : ativa, menos condensada, replica cedo na fase S. Heterocromatina : seqüências repetidas, mais condensada, replica tarde na fase S. H. Constitutiva : sempre inativa (pericentromérica e braço longo do cromossomo Y ). H. Facultativa : inativa e ativa (cromossomo X)

19 CULTURA CELULAR MEIO DE CULTURA: RPMI 1640, TC 199, HAM F10, dependerá do tipo celular a ser cultivado. SORO FETAL: Bovino ou humano. Presença de fatores de crescimento celular. AGENTE MITOGÊNICO: Fito-hemaglutinina, etc se for necessário.. AGENTE BLOQUEADOR DA DIVISÃO CELULAR: Inibidores do fuso: Colchicina; vinblastina. SOLUÇÂO HIPOTÔNICA: Tumefação das células; Solução salina ( KCl; Citrato de sódio; etc...)

20 Cariótipo - Técnica Sangue perférico (linfócitos);
Meio de cultura ( RPMI/199 ,soro, fito-hemaglutinina) Incubar à 37ª C por 72 horas; Adicionar colchicina; e a solução hipotônica; Fixar o material; Distribuir em lâminas; bandas; coloração(GIEMSA); Observar em MO; Selecionar, fotografar e montar o cariótipo; Resultado.

21 ESQUEMA DO CARIÓTIPO EM SANGUE PERIFÉRICO

22 METÁFASE HUMANA

23 BANDAS G cromossomos submetidos à ação de uma enzima - tripsina que desnatura as proteínas cromossômicas; coloração posterior com corante de Giemsa; as bandas G escuras são regiões ricas em AT. cada cromossomo com padrão típica de regiões claras e escuras.

24 NOMENCLATURA

25 NOMENCLATURA DO CARIÓTIPO HUMANO – PADRÃO BG

26 BANDAS G

27 CARIÓTIPO FEMININO

28 BANDAS Q cromossomos corados com corantes fluorescentes (quinacrina-mostarda; DAPI...); regiões cromossômicas ricas em AT; cromossomos com padrão de bandas brilhantes e opacas; análise feita em microscópio de fluorescência (UV); diferenciação longitudinal dos cromossomos.

29 BANDAS Q

30 BANDAS R cromossomos são desnaturados com o uso de solução salina e calor; coloração posterior com corante de Giemsa; cada cromossomo com padrão típica de regiões claras e escuras; as bandas R escuras são regiões ricas em GC; padrão inverso das bandas Q e G; diferenciação longitudinal dos cromossomos.

31 BANDAS R

32 COMPOSIÇÃO DAS BANDAS CROMOSSÔMICAS
Padrão de banda BANDAS G/ Q BANDAS R Propriedades Contém DNA rico em AT (55-60%); Replicação tardia na fase S Contém poucos genes; DNA rico em GC (50-60%) Replicação precoce na fase S Contém a maioria dos genes

33 BANDAS DE ALTA RESOLUÇÃO
cromossomos no estágio de pró-metáfase, menos condensados; técnica de bandas G, Q ou R coloração posterior com corante de Giemsa; maior número de bandas; detecção de alterações cromossômicas estruturais menores.

34 SÍTIOS FRÁGEIS zonas de instabilidade cromossômicas;
cultura especial com meio pobre em timidina e ácido fólico ou um inibidor da timidina sintetase (metatrexate ou fluordesoxiuridina); coloração com uso de Giemsa; sítios frágeis visualizados como falhas ou quebras cromossômicas; regiões susceptíveis a quebras cromossômicas;

35 SÍTIO FRÁGIL

36 BANDAS C cromossomos submetidos a ação de uma solução de hidróxido de bário; coloração posterior com corante de Giemsa; desnaturação da eucromatina e heterocromatina facultativa; marcação da heterocromatina constitutiva; regiões centroméricas dos cromossomos e outras regiões que contenham heterocromatina constitutiva (braço longo do Y).

37 BANDA C

38 Nomenclatura de Bandas

39 HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA (FISH)
O FISH é a técnica na qual um segmento de DNA cromossômico específico (sonda) é hibridizado com cromossomos metafásicos, profásicos ou interfásicos, e então observado com microscopia de fluorescência. Sonda locus específica Sonda centromérica Sonda para marcar todo o cromossomo

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42 FISH

43 FISH EM CÉLULA NEOPLÁSICA