RNA interference in biology and disease

Apresentação em tema: "RNA interference in biology and disease"— Transcrição da apresentação:

1 RNA interference in biology and disease
Carol A. Sledz and Bryan R. G. Williams Blood, 1º de Agosto de 2005/ volume 106, nº3 Apresentação: Francisco André Marques de Oliveira Cariri Mariana Marques de Sá Coutelo Chagas

2 Silenciamento do gene específico
Introdução RNA interference (RNAi): Processo pós-transcricional RNA fita-dupla (dsRNAs) Silenciamento do gene específico (Degradação do mRNA) Processo que ocorre naturalmente em diversos organismos 1. Proteger os organismos contra vírus 2. Eliminar produtos de degradação anômalos Funções:

3 Introdução 1928 - Descrito primeiramente em plantas.
Planta Tabaco infectada com vírus – Níveis altos de resistência. (Wingard SA, 1928) Primeiro trabalho utilizando a técnica de RNAi: Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. (Fire A. and Cols., 1998) Hibridização do RNA marcado com o mRNA dsRNA Antisense Micrografia de contraste

4 Introdução 2001 – Análises em Drosophilas (RNAi em 2 etapas)
Descoberta da clivagem do dsRNA em Drosophila. Fragmentos de 21 a 23 nt (siRNAs) Descoberta da clivagem do mRNA em Drosophila. (Zamore and cols., 2001) Processo de RNAi provocado experimentalmente – (siRNAs sintéticos) Síntese química e transcrição in vitro Kits produzidos por empresas

5 Introdução RNAi realizado com plasmídeos – expressão de siRNAs
Grampos de siRNAs (shRNAs) sob o controle de uma RNA pol III Inicia a síntese a uma distância conhecida dos promotores Termina quando encontra cadeia de 4 a 5 uridinas.

6 Introdução Outros dois tipos de silenciamento de genes:
1. Silenciamento do mRNA por micro RNAs endógenos (miRNAs) Formação de uma grampo de RNA fita dupla Degradação de mRNAs anômalos ou produzidos indevidamente 2. Silenciamento por modificação do empacotamento do DNA celular e Histonas que levando ao silenciamento transcricional da heterocromatina.

7 Mecanismo de Ação Passo inicial: adição de dsRNA que é reduzido a partes menores conhecidas como siRNA. Estes por sua vez se ligam a complexos enzimáticos endoribonucleases RISC. Passo efetor: siRNA se conjugam ao RISC e são guiados ao mRNA, onde ocorrem as clivagens

8 Mecanismo de Ação Enzimas: DICER RISC

9 Características da técnica
Eficiente em baixo número de cópias e altamente específico Manutenção e persistência Efeito rápido e eficaz

10 Experimentos genômicos
Cientistas estão utilizando esta tecnologia para desativar genes humanos ou de agentes transmissores de doenças. Já foram desenvolvidos instruções para silenciar, de maneira rápida e eficiente, genes humanos.

11 HIV Silenciamento de células com HIV está sendo feito “in vitro”
Bloqueio da invasão e replicação do vírus

12 Câncer Pesquisadores têm silenciado mais de uma dúzia de genes
Pesquisadores estão trabalhando para decifrar genes em uma variedade de Câncer

13 Hepatite C Experimentos em ratos obteve sucesso
Produção de vetores virais para tratamento de células humanas

14 Doença de Huntington RNAi pode silenciar genes problemáticos
O tratamento também têm silenciado genes saudáveis

15 Infecções respiratórias
Criação de drogas inalatórias que poderão servir para o tratamento de SARS e influenza. RNA são inalados e atingem seus alvos intactos e controlam vírus.

16 Aplicações do RNAi

17 Aplicações do RNAi

18 Limitações da RNAi Contruir uma seqüência efetiva de siRNAs que possa ser reconhecida e amplificada pelas polimerases. (Limitação vem sendo diminuída) Eficácia do RNAi depende: Estrutura do siRNA Receptividade do tipo celular Meia vida do mRNA e/ou proteína Aumento cada vez maior da estabilidade (“in vivo”) Avanços estão sendo realizados para fazer os siRNAs adequados para propostas terapêuticas.

19 Efeitos não específicos e fora do alvo da RNAi
2 considerações importantes: 1. Mecanismo eficiente do siRNA “ in vivo ”. 2. Evitar efeitos não específicos ou fora do alvo do siRNAs. siRNAs ativando uma resposta celular alternativa, regulando genes associados com a resposta imune. Alteração da expressão de outros genes em resposta a presença do siRNA. Interferon – citocinas da primeira linha de defesa contra infecções virais em mamíferos, que induz a ativação transcricional de genes. Produto dos genes ativados – atividade antiviral e antiproliferativa. Ativação da resposta imune inata é ativada pelos dsRNAs

20 Conclusões Cada vez mais o RNAi vem sendo utilizado em aplicações médicas e científicas, consolidando-se como uma poderosa ferramenta de silenciamento gênico. Estratégias para aumentar o nível de eficiência da RNAi e minimizar os efeitos não específicos ou fora do alvo: Utilizar informações disponíveis para sintetizar siRNAs mais específicos e que possam ser usados numa concentração cada vez menor, mas mantendo a sua eficácia. Utilizar os siRNAs contra as sequências alvo sem que eles causem efeitos não específicos; 3. Resgatar fenótipos causados pela expressão de um siRNA ectópico de um gene que não poderia ser silenciado pelo siRNA.

21 OBRIGADO!!!!!