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RNA interference in biology and disease Carol A. Sledz and Bryan R. G. Williams Apresentação: Francisco André Marques de Oliveira Cariri Mariana Marques.

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1 RNA interference in biology and disease Carol A. Sledz and Bryan R. G. Williams Apresentação: Francisco André Marques de Oliveira Cariri Mariana Marques de Sá Coutelo Chagas Blood, 1º de Agosto de 2005/ volume 106, nº3

2 Introdução RNA interference (RNAi): Processo pós-transcricional RNA fita-dupla (dsRNAs) Silenciamento do gene específico (Degradação do mRNA) Processo que ocorre naturalmente em diversos organismos 1. Proteger os organismos contra vírus 2. Eliminar produtos de degradação anômalos Funções:

3 Descrito primeiramente em plantas. Planta Tabaco infectada com vírus – Níveis altos de resistência. (Wingard SA, 1928) Primeiro trabalho utilizando a técnica de RNAi: Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. (Fire A. and Cols., 1998) Antisense dsRNA Introdução Hibridização do RNA marcado com o mRNA Micrografia de contraste

4 2001 – Análises em Drosophilas (RNAi em 2 etapas) Descoberta da clivagem do mRNA em Drosophila. (Zamore and cols., 2001) Descoberta da clivagem do dsRNA em Drosophila. Fragmentos de 21 a 23 nt (siRNAs) Processo de RNAi provocado experimentalmente – (siRNAs sintéticos) Síntese química e transcrição in vitro Kits produzidos por empresas Introdução

5 RNAi realizado com plasmídeos – expressão de siRNAs Grampos de siRNAs (shRNAs) sob o controle de uma RNA pol III Introdução Inicia a síntese a uma distância conhecida dos promotores Termina quando encontra cadeia de 4 a 5 uridinas.

6 Outros dois tipos de silenciamento de genes: 1. Silenciamento do mRNA por micro RNAs endógenos (miRNAs) Formação de uma grampo de RNA fita dupla 2. Silenciamento por modificação do empacotamento do DNA celular e Histonas que levando ao silenciamento transcricional da heterocromatina. Introdução Degradação de mRNAs anômalos ou produzidos indevidamente

7 Passo inicial: adição de dsRNA que é reduzido a partes menores conhecidas como siRNA. Estes por sua vez se ligam a complexos enzimáticos endoribonucleases RISC. Passo efetor: siRNA se conjugam ao RISC e são guiados ao mRNA, onde ocorrem as clivagens Mecanismo de Ação

8 Enzimas: – DICER – RISC

9 Eficiente em baixo número de cópias e altamente específico Eficiente em baixo número de cópias e altamente específico Manutenção e persistência Manutenção e persistência Efeito rápido e eficaz Efeito rápido e eficaz Características da técnica

10 Experimentos genômicos Cientistas estão utilizando esta tecnologia para desativar genes humanos ou de agentes transmissores de doenças. Já foram desenvolvidos instruções para silenciar, de maneira rápida e eficiente, genes humanos.

11 HIV Silenciamento de células com HIV está sendo feito in vitro Bloqueio da invasão e replicação do vírus

12 Câncer Pesquisadores têm silenciado mais de uma dúzia de genes Pesquisadores estão trabalhando para decifrar genes em uma variedade de Câncer

13 Hepatite C Experimentos em ratos obteve sucesso Produção de vetores virais para tratamento de células humanas

14 Doença de Huntington RNAi pode silenciar genes problemáticos O tratamento também têm silenciado genes saudáveis

15 Infecções respiratórias Criação de drogas inalatórias que poderão servir para o tratamento de SARS e influenza. RNA são inalados e atingem seus alvos intactos e controlam vírus.

16 Aplicações do RNAi

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18 Contruir uma seqüência efetiva de siRNAs que possa ser reconhecida e amplificada pelas polimerases. (Limitação vem sendo diminuída) Limitações da RNAi Eficácia do RNAi depende: Estrutura do siRNA Receptividade do tipo celular Meia vida do mRNA e/ou proteína Aumento cada vez maior da estabilidade (in vivo) Avanços estão sendo realizados para fazer os siRNAs adequados para propostas terapêuticas.

19 Efeitos não específicos e fora do alvo da RNAi 1. Mecanismo eficiente do siRNA in vivo. 2. Evitar efeitos não específicos ou fora do alvo do siRNAs. siRNAs ativando uma resposta celular alternativa, regulando genes associados com a resposta imune. Alteração da expressão de outros genes em resposta a presença do siRNA. Interferon – citocinas da primeira linha de defesa contra infecções virais em mamíferos, que induz a ativação transcricional de genes. Ativação da resposta imune inata é ativada pelos dsRNAs Produto dos genes ativados – atividade antiviral e antiproliferativa. 2 considerações importantes:

20 Conclusões Estratégias para aumentar o nível de eficiência da RNAi e minimizar os efeitos não específicos ou fora do alvo: 1.Utilizar informações disponíveis para sintetizar siRNAs mais específicos e que possam ser usados numa concentração cada vez menor, mas mantendo a sua eficácia. 2.Utilizar os siRNAs contra as sequências alvo sem que eles causem efeitos não específicos; 3. Resgatar fenótipos causados pela expressão de um siRNA ectópico de um gene que não poderia ser silenciado pelo siRNA. Cada vez mais o RNAi vem sendo utilizado em aplicações médicas e científicas, consolidando-se como uma poderosa ferramenta de silenciamento gênico.

21 OBRIGADO!!!!!


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