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Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale Science 24 October 1997: Vol. 278. no. 5338, pp. 680 - 686 DOI: 10.1126/science.278.5338.680.

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1 Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale Science 24 October 1997: Vol no. 5338, pp DOI: /science Joseph L. DeRisi, Vishwanath R. Iyer, Patrick O. Brown *

2 Introduçao O padrão de genes expressados uma célula pode prover detalhada informação sobre seu estado. Todas as diferenças em uma célula o estado podem correlacionasse câmbios nos níveis de ARNm

3 Saccharomyces cerevisiae organismo favorável Seqüenciado em genoma Os genes são fácies de reconhecer Elementos regulatorios cis perto e são compactos Mecanismos regulatorios genéticos

4 Produção de etanol etanol Cambio de fermentação anaeróbica a respiração aeróbica Cambio diaúxico Fonte de carbono respiração aeróbica Quando o açúcar se acaba Leveduras em médio rico em glicose Rápido crescimento

5 Se correlaciona com amplios câmbios em na expressão de genes Tales como metabolismo de carbono Sintesis de proteína Armazenamento de carboidratos Involucran processos celulares fundamentais

6 DNA microarrays Se pode analisar todo o gnoma Caracteriza câmbios em expressão dos genes O circuito genético regulatorio

7 Os marcos abertos de leitura (ORFs) amplificados PCR Com um set de primer comerciais ADN microarrays 6400 seqüências distintas de ADN empreso em slides de vidros Com um robot Células de levedura de um cultivo em crescimento exponencial em médio fresco e crescidas a 30 C por 21 hs Logo de 9 hs de crescimento a glicose começo a escassear em médio Se tomarem mostras Em 7 intervalos sucessivos de 2 hr cada uno E ARNm foi isolado Materiais e métodos

8 ADNc se preparo por transcritasa reversa Em presencia deoxi-uridina Cy3(verde) Cy5 (vermello) E logo hibridizada o microarray trifosfato marcada (dUTP) Se determino intensidade na fluorescência relativa para os fluorescentes para cada array

9 Fig. 1. Yeast genome microarray. -labeled cDNA (mRNA expression at the initial timepoint) is represented as a green signal, Cy3-dUTP hybridization of Cy5-dUTP- labeled cDNA (that is, mRNA expression at 9.5 hours) is represented as a red signal. after the diauxic shift genes induced red repressed as green spots yellow spots. Genes expressed equal levels before and after the diauxic shift Resultados

10 Fig. 2. The section of the array indicated by the gray box in Fig. 1 Representative genes are labeled. red spots represent genes that were induced relative to the initial timepoint, green spots represent genes that were repressed relative to the initial timepoint.

11 Crescimento exponencial médio rico em glicose Fig. 5. Distinct temporal patterns of induction or repres... Padrão de expressão estável Tempo 0hs - 2hs células Níveis de ARNm 19 genes (0.3%) maior a 2 vezes (major de 2.7 vezes) Fig. 4. Coordinated regulation of functionally related ge... 1er intervalo sin glicose

12 400 sim homologia 2hs Aumenta na falta de glicose Niveles de ARNm 2 vezes 710 genes 4 vezes 183 genes 2 vezes 1073 genes 9hs 4 vezes 203 genes 50% sim função e sim nome possíveis funções Fig. 4. Coordinated regulation of functionally related ge... Seguintes intervalos

13 induções enzima aldeído deshidrogenase (ADL2) acetil- coenzima A sintasa (ACS1) ACS1 ciclo glioxilato Acetil-CoA TCA Fig. 4. Coordinated regulation of functionally related ge... piruvato decarboxilase PDC1PDC1 piruvato carboxilase redirecionam piruvato acetaldehido oxalacetato TCA Gluconeogenesis

14 Trealosa sintasa Glicogênio sintasa Via de armazenamento cambio na direção de glicolisis PCK1PCK1 (fosfoenolpiruvato carboxiquinasa) FBP1FBP1 (fructosa 1,6 bifosfato) biosintesis precursores glicose 6 fosfato o padrão de expressão observado foi perfeitamente correla...

15 Fig. 3. Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression. Red boxes with white lettering identify genes whose expression increases in the diauxic shift. Green boxes with dark green lettering identify genes whose expression diminishes in the diauxic shift. The magnitude of induction or repression is indicated for these genes. Black and white boxes indicate no significant differential expression (less than twofold).

16 Genes relacionados funcionalmente Genes relacionados al citocromo C Ciclo acido tricarboxilico- glioxilato Armazenamento de carboidratos Proteínas ribosômais 95% genes ARNt sintetasa Genes relações sintesis de proteínas Fatores de elongações, traduções e finalizações 2 vc Decrescimento coordenado Ex genes mitocôndrias ribossômicos aumento na biogêneses mitocôndrias

17 Padrões de expressão Agrupamentos de genes por sua função Mecanismo regulatorio Inferir padrões similar deexpressão 7 genes se induziram tardiamente (5B) o elemento de resposta a na fonte de carbono CSRE (carbon source response element) 5 genes compartem uma seqüência ativadora águas arriba 2 genes ACR1 gen essencial para na atividade de ACS1ACR1 Genes reprimidos por glicose IDP2IDP2( isocitrato desidrogenase) no ten CSRE Slide 23

18 Elementos de resposta a estresse (STRE) motivo CCCT (5C) elemento ativador águas arriba (UAS rpg) Proteínas ribosômais (5F) 7 genes 4.4 veces Corrobora de proteínas ribosômais RAP1 expressão Slide 24

19 Genes codificam fatores de transcrição 149 genes HAP4HAP4 3 vc ( ativador transcricinal e regulador global da expressão dos genes respiratorios) SIP4 SIP4 8 vc (ativador da transcrição unem a ADN ) interação com snf1psnf1p o regulador maestro da repressão de glicose

20 o padrão de expressão observado foi perfeitamente correlacionado com os dados prévios ADN microarrays Permite caracterizar as vias regulatorias Outorga uma ferramenta para explorar o padrão de expressão a escale genómica permite caracterizar as consecuencias metabolicas por câmbios no medio de cultura

21 Fig. 4. Coordinated regulation of functionally related genes. The curves represent the average induction or repression ratios for all the genes in each indicated group. The total number of genes in each group was as follows: ribosomal proteins, 112; translation elongation and initiation factors, 25; tRNA synthetases (excluding mitochondial synthetases), 17; glycogen and trehalose synthesis and degradation, 15; cytochrome c oxidase and reductase proteins, 19; and TCA- and glyoxylate-cycle enzymes, 24.

22 Fig. 5. Distinct temporal patterns of induction or repression help to group genes that share regulatory properties. (A) Temporal profile of the cell density, as measured by OD at 600 nm and glucose concentration in the media. (B) Seven genes exhibited a strong induction (greater than ninefold) only at the last timepoint (20.5 hours). With the exception of IDP2, each of these genes has a CSRE UAS. There were no additional genes observed to match this profile.

23 (C) Seven members of a class of genes marked by early induction with a peak in mRNA levels at 18.5 hours. Each of these genes contain STRE motif repeats in their upstream promoter regions. (D) Cytochrome c oxidase and ubiquinol cytochrome c reductase genes. Marked by an induction coincident with the diauxic shift, each of these genes contains a consensus binding motif for the HAP2,3,4 protein complex. At least 17 genes shared a similar expression profile.

24 (E) SAM1, GPP1, and several genes of unknown function are repressed before the diauxic shift, and continue to be repressed upon entry into stationary phase. (F) Ribosomal protein genes comprise a large class of genes that are repressed upon depletion of glucose. Each of the genes profiled here contains one or more RAP1-binding motifs upstream of its promoter. RAP1 is a transcriptional regulator of most ribosomal proteins.

25 ACS1 Acetyl-coA synthetase isoform, expressed during growth on nonfermentable carbon sources and under aerobic conditions

26 PDC1 Major of three pyruvate decarboxylase isozymes, key enzyme in alcoholic fermentation, decarboxylates pyruvate to acetaldehyde; subject to glucose-, ethanol-, and autoregulation; involved in amino acid catabolism PCK1 (fosfoenolpiruvato carboxiquinasa) Phosphoenolpyruvate carboxykinase, key enzyme in gluconeogenesis, catalyzes early reaction in carbohydrate biosynthesis, glucose represses transcription and accelerates mRNA degradation, regulated by Mcm1p and Cat8p, located in the cytosol FBP1 (fructosa 1,6 bifosfato) cambio na direção de glicolisis biosintesis de precursores glicose 6 fosfato Fructose-1,6-bisphosphatase, key regulatory enzyme in the gluconeogenesis pathway, required for glucose metabolism

27 ACR1 Mitochondrial succinate-fumarate transporter, transports succinate into and fumarate out of the mitochondrion; required for ethanol and acetate utilization IDP2 Cytosolic NADP-specific isocitrate dehydrogenase, catalyzes oxidation of isocitrate to alpha-ketoglutarate; levels are elevated during growth on non-fermentable carbon sources and reduced during growth on glucose

28 RAP1 (repressor activator protein 1) DNA-binding protein involved in either activation or repression of transcription, depending on binding site context

29 HAP4 Subunit of the heme-activated, glucose- repressed Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-binding complex, a transcriptional activator and global regulator of respiratory gene expression; provides the principal activation function of the complex ( SIP4 C6 zinc cluster transcriptional activator that binds to the carbon source-responsive element (CSRE) of gluconeogenic genes; involved in the positive regulation of gluconeogenesis; regulated by Snf1p protein kinase; localized to the nucleus

30 SNF1 AMP-activated serine/threonine protein kinase found in a complex containing Snf4p and members of the Sip1p/Sip2p/Gal83p family; required for transcription of glucose-repressed genes, thermotolerance, sporulation, and peroxisome biogenesis. Transcriptional regulation is an important mechanism for controlling carbon metabolism in Saccharomyces cerevisiae.


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