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Lessons from an Evolving rRNA: 16S and 23S rRNA Structures from a Comparative Perspective ROBIN R. GUTELL,I NIELS LARSEN, AND CARL R. WOESE Microbiological.

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1 Lessons from an Evolving rRNA: 16S and 23S rRNA Structures from a Comparative Perspective ROBIN R. GUTELL,I NIELS LARSEN, AND CARL R. WOESE Microbiological Reviews, Março de 1994 Edilene Andrade Rodrigo Lucena

2 Estrutura Molecular do rRNA Estrutura tridimensional estável Molécula unifilamentar Molécula bifilamentar Desenvolvimento do Modelo: Exame da seqüência de nucleotídeos do rRNA de E. Coli e identificação das regiões que podem formar pares de bases. Comparação das seqüências da E. Coli com as seqüências semelhantes dos rRNAs equivalentes de outros procariontes regiões de pareamento conservadas Tratamento do rRNA nas regiões de pareamento com ribonucleases.

3 Figura 1. rRNA 16S

4 Figura 2. rRNA 23S

5 Os RNAs biologicamente ativos adotam uma estrutura estática ou alostérica? As dobras do RNA ocorrem de forma termodinâmica ou cinética? As moléculas de RNA requerem moléculas auxiliares para modificar sua conformação? Há um modelo para estabelecer a estrutura dos RNAs? As regiões conservadas no rRNA também são encontradas no tRNA ou vice-versa? Que tipo de máquina é o ribossomo e quais são os seus mecanismos moleculares?

6 Análises Comparativas de Seqüências Todos os RNAs parecem ser semelhantes em função produção de proteínas A estrutura tridimensional do rRNA é aproximadamente constante Covariação de posição Análises comparativas estrutura de ordem superior A freqüência e os modelos de mudança de um dado nucleotídeo em uma molécula são característicos de sua localização e podem ser comparadas entre diferentes organismos. Justaposição das regiões de grande similaridade: seqüências homólogas (convergentes) contra similaridade estrutural (homologia).

7 Dados das Seqüências Estrutras secundárias Estruturas terciárias (poucas bases cujas composições podem variar e cujas interações não envolvem necessariamente pareamentos canônicos (Watson-Crick). A primeira seqüência do rRNA 16S foi determinada em 1978 e hoje chega a A primeira seqüência rRNA 23S foi determinada em 1980 e hoje chega a mais de 250.

8

9 Pares G:U parecem estar envolvidos em sítios de reconhecimento de enzimas. Tipo não variante: sua composição é a mesma nos três domínios. Seqüências altamente conservadas. Tipo dominante (D): realizam trocas recíprocas com pares canônicos, mas são predominantes nos rRNAs 16S em quase todos os grupos bacterianos. (Eu) Bacteria: em 55% dos rRNAs 16S U:G é predominante (U:G G:U) Archaea: G:U = U:G Tipo incomum: raramente mudam de composição, mas quando a mudança ocorre é quase sempre U:G C:A Em 98% das (Eu) Bacteria o par 249:275 é constante (Fig. 3). Par 1512:1523 torna-se C:A no Plasmodium fragile mas permanece U:G em outras espécies de Plasmodium (Fig. 4).

10 Figura 3

11 Figura 4

12 Figura 5. Grupo de pares G:U

13 Pares G:A ocorrem tanto nas regiões terminais quanto no interior das hélices, em pares isolados ou em grupos contíguos. Em todas as (Eu) Bacteria o par 1357:1365 está próximo de um loop de sete bases (Fig. 6). As posições correspondentes ao par 1357:1365 formam pares canônicos apenas nos Archaea e em quase todos os Eucarya (Fig. 6). A forma predominante é A:G G:A ou A:A. Nos Archaea a ocorrência dos pares G:A na região 665 é pronunciada, podendo conter até quatro pares (Fig. 7). Outros pares G:G, A:A e Y:Y são raros. Pares G:G ocorrem em todas as bactérias redutoras de sulfato (β e γ e algumas α e δ) e em outros grupos (Fig. 8). O par U:U é predominante nos três domínios. Pode mudar para C:C, sua única forma alternativa (Fig. 8).

14 Figura

15 Figura 16S canto esquerdo superior posição 663 a 665 Figura 7

16 Figura 8

17 Resíduos de Projeções Unilaterais encontrados nos três domínios. Resíduo 31: encontrado em todas as subunidades pequenas das (Eu) Bacteria mas não está presente nas Archaea (Fig. 9). Resíduo 397: nas Archaea a base da posição correspondente sempre está pareada (Fig. 9). Podem dobrar a hélice nas quais são encontrados

18 Figura 9 Resíduo 31 Resíduo 397

19 Resíduos de Projeções Bilaterais No filo flavobacterial e nos Archaea as posições 1260:1275 exibem uma forte covariação (Fig. 10). O par 1261:1274 exibe covariação apenas nos Archaea (Fig. 10). O par 1262:1273 mostra uma forte covariação nas Archaea e em muitos filos (Fig. 10). No rRNA 23S ocorre uma estrutura característica das (Eu) Bacteria que apresenta quatro pareamentos incomuns (Fig. 11).

20 Figura

21 Figura 23S região 1852 a 1859 da página 15, parte esquerda superior Figura 11

22 Extensão Teminal das Hélices As covariações entre as bases subterminais são evidentes em apenas alguns grupos de bactérias. A covariação da posição 768:811 é evidente entre as bactérias, archaea e mitocôndrias (Fig. 12). Nas posições 1258 até 1277 a composição pode ser R:R ou Y:Y e freqüentemente se alternam filogeneticamente (Fig. 13). Posição 152:169 a covariação ocorre em todos os grupos de bactérias. Envolve conversões A:C G:U e outras combinações não canônicas (Fig. 14).

23 Figura 16S canto esquerdo superior posição 768 a Figura 12

24 Figura

25 Figura 14

26 Motivos interessantes na Estrutura Secundária Posição 1308:1329 GGAU (Fig. 15) AAGU Posição 25-29: do rRNA 23S UGGAU AAAGU Apenas o par U:A é variável (Fig. 16) Um nucleotídeo extra após a posição 130 está relacionado com um aumento de três a nove pares no comprimento da hélice ( : ) (Fig. 17).

27 Figura 15

28 Figura 23S, página 14, posição logo abaixo de I Figura 16

29 Figura

30 Interações terciárias: Pares únicos e elementos estruturais incomuns Pares únicos Pares individuais não são estáveis por si só. Mas podem fazer parte de algumas estruturas como uma estrutura coaxial helicoidal posição (Figura 18). Variações na composição de U:U – C:C em bactéria e archaea são vistas como transições filogeneticamente independentes entre os dois. U1307-U:1330 (Figura 19). Estes tipos de ligações são sustentadas por duas pontes de hidrogênio. Existem também pares únicos de G:G nas posições 722 e 733 (Figura 20). Esta composição alterna exclusivamente com A:A, qual ocorre filogeneticamente independentes.

31 Figura 18 Figura 19 Figura 20

32 Interações terciárias: Pares únicos e elementos estruturais incomuns Pares únicos C:G na posição 47:361 em eubactérias; para U:A em todos spirochetas e G:A em todos os membros de planctomyces/chylmidia. A composição é uniforme G:C entre as archaeas e U:A para os eucaryotes (Figura 21). A variação entre bactéria e archaea (438:496) é de U:A - G:G e é filogeneticamente independente (Figura 22). As regiões em volta da posição 1400 e 1500 do 16S rRNA são consideradas as mais conservadas na biologia (Figura 23).

33 Figura 21 Figura 22

34 Figura 23

35 Uma provavel Tripla Covariância no 16S rRNA As posições 440, 494 e 497 apresentam covariaça Entretanto de maneira menos acentuada que na estrutura secundaria (Figura 24). Em bactérias púrpuras covariam as regiões 440 e 497 (Figura 24). Já em cianobacterias as posições 440 e 494 covariam (Figura 24). Ao redor destes pares existe uma ligação não canonical de pares (438:496). Isto indica a existência de um complexo de importantes interações estruturais e funcionais (Figura 24).

36 :496 Figura 24

37 Tetraloops Possivelmente é a estrutura mais proeminente e de fácil reconhecimento no rRNA que se tem conhecimento. Um loop de quatro nucleotídeos sustentados por dois pb ou mais. Existem várias possibilidades para os 18 tetraloops encontrados no 16S rRNA e após testes com ressonância magnética nuclear, os tipos mais predominantes são: Para início e fim: C----G, U----G e G----A; No interior: UUCG, CUUG e GMAA (M = A ou C); e GCAA com R:Y. Existe correlação: C----G com UUCG e G----C com CUUG.

38 Tetraloops O tetraloop 83 para o 86 é o mais variável de todos em 93% dos casos (Figura 25). Possivelmente evoluíram de tri ou pentaloops intermediários por meio de inserções-deleções. Devem ter sofrido forte seleção pois existem mais de 4000 possibilidades. Os tetraloops devem ter um papel importante nas interações existentes em todo o contexto do rRNA, certamente devem auxiliar no dobramento da estrutura.

39 (Figura 25).

40 Pseudoknots Frequentemente são motivos do rRNA. Interação entre bases dentro de um hairpin loop, um bulge loop e um capping loop. No 16S rRNA existem 3 e no 23S, 15. O pareamento : (Figura 26). no 16S rRNA é baseado em três exemplos filogeneticamentes independentes de mudança em mitocôndrias de Chlmydomonas reinhardtii; em dois nematódeos Caenorhabdits elegans e Ascaris suum; e no cogumelo Suillus sinuspaulianos O os dois últimos pares de base do tetraloop 863 interagem com os da posição 570:571 proximo a uma hélice. Possui covariação U:C-G:R. Isto sugere uma complexidade ainda maior (Figura 26).

41 521: :528 Tetraloop 570:571 Outro Pseudoknot Figura 26

42 Coaxial Helices São hélices que possuem uma mesma haste de sustentação comum. As hélices são importantes na comparação de grupos, pois podem variar em tamanho como, por exemplo, as hélices envolvendo as posições : e : (Figura 27). Em Eubactéria as duas hélices possuem 5 e 7 pb, enquanto em Archaea e Eucarya possuem 6 pb cada.

43 Estão ligados Estão ligados Esquema Hélices Haste Comum (Figura 27).

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45 Summary and Conclusions As estruturas dos 16S e 23 S rRNA foram elucidadas utilizando- se métodos de análises comparativas. Percebe-se que grande parte da seqüência estabelece a estrutura secundaria. Entretanto a seqüência não é suficiente para determinar a estrutura terciária e função, pois o ribossomo interage com o rRNA. A covariança de bases possivelmente promove uma proteção contra modificações químicas nas bases visinas. Por meio destes estudos pode-se criar algorítimos para prever dobramentos estruturais e assim ter mais precisão na investigação das estruturas secundarias e terciarias. A essência da função do ribossomo provavelmente envolve uma dinâmica movimentação do rRNA na estrutura. Atraves da combinação de técnicas será possível produzir uma imagem do ribossomo funcionando.

46 Obrigado


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