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Transformação de Plantas Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração Método de transferência de gene Identificação de células transformadas.

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Apresentação em tema: "Transformação de Plantas Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração Método de transferência de gene Identificação de células transformadas."— Transcrição da apresentação:

1 Transformação de Plantas Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração Método de transferência de gene Identificação de células transformadas por seleção Regeneração de plantas de células transformadas Plantas transgênicas analisadas para confirmar presença do transgene - herança e estabilidade Plantas transgênicas avaliadas para performance

2 Transferindo genes para plantas O processo de introdução de genes em plantas chama-se transformação genética O gene sendo transferido para a planta é chamado de transgene Plantas com modifiçações genética são denominadas de transformadas ou transgênicas Denominação geral = Organismos Geneticamente Modificados (OGM)

3 Transferindo DNA para células de plantas Célula Vegetal núcleo parede celular membrana citoplasmática transgene 1. DNA pode ser transferido por meio biológico (Agrobacterium) ou físico (bombardeamento) 2. DNA deve cruzar várias barreiras 3. DNA deve se integrar ao cromossomo no núcleo da célula 4. Cada célula transformada é única 5. Número de células transformadas é mínimo citoplasma

4 Cronologia da Transformação de Plantas 1907Identificação de Agrobacterium tumefaciens como agente causal de galhas 1974Descoberta de elemento extra-cromossomial ligado à indução de galhas 1975Aquisição de habilidade oncogênica por transferência de plasmídeo 1977Transferência e manutenção de T-DNA em células de plantas 1980Uso de plasmídeo Ti para introdução de genes em plantas 1981Transmissão Mendeliana de genes introduzidos por Ti 1983Construção de genes marcadores quiméricos Engenharia de vetor Ti para introdução de genes sem oncogênese 1984Regeneração de plantas resistentes à kanamicina com herança Mendeliana 1985Estabelecimento de transformação e regeneração por disco foliar 1987Transformação através de bombardeamento com micropartículas

5 Transformação de Plantas 1. Agrobacterium tumefaciens como vetor –método de escolha –limitação de hospedeiro 2. Bombardeamento com micropartículas –usado em Monocotiledôneas e Legumes –versatilidade de tecido alvo 3. Protoplastos –célula vegetal sem parede celular –totipotência - similar a bactéria –permeabilização reversa membrana PEG Eletroporação

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7 Agrobacterium tumefaciens Bactéria de solo Gram-negativa, tipo bacilo Causa galha da coroa (crown gall): videira, maçã, etc Afeta mais dicotiledôneas e pouco monocotiledôneas Família Rhizobiaceae Outras espécies: –Agrobacterium rhizogenes -raiz em cabeleira (hairy root) –Agrobacterium rubi - hospedeiros limitados –Agrobacterium radiobacter - não tumorogênica (sem Ti)

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10 Agrobacterium Biovar: características fisiológicas, químicas e nutricionais Biovar I: A. tumefaciens, A. radiobacter e poucas A. rhizogenes Biovar II: maioria A. rhizogenes e A. rubi Biovar III: A. viti (A. tumefaciens)

11 Agrobacterium Infecção natural - ferimentos Quimiotactismo - fenóis, açúcares, amino ácidos Formação de tumores Expressão de genes da bactéria transferidos e integrados de forma estável ao genoma vegetal Capacidade tumorogênica - plasmídeo Ti = –Ti = Tumor Inducing a 250 kpb Regiões do plasmídeo Ti importantes: –região T-DNA - Transfer DNA –região vir - genes de virulência

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13 Agrobacterium Região T-DNA Tamanho: de 12 a 24 kb Limitada por seqüências repetidas diretas imperfeitas –bordas direita (RB) e esquerda (LB) - delimitam T-DNA Contém genes de síntese de reguladores de crescimento (hormônios vegetais) e de opinas Transferem genes para direcionar metabolismo para manutenção da Agrobacterium

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15 Agrobacterium Região T-DNA Síntese de reguladores de crescimento Auxina –genes iaaM (tms1): triptofano 2-monooxigenase –gene iaaH (tms2): indol-3-acetamida Citocinina –gene tmr: isopentenil transferase adição de cadeia isopentenil a 5-AMP adição de OH = transzeatina

16 iaaM (tms1) iaaH (tms2) ipt ( tmr )

17 Agrobacterium Região T-DNA Síntese de opinas compostos únicos e incomuns fonte de C e N para Agrobacterium favorece transferência conjugativa de Ti condensação de açúcares ou ácido orgânico + amino ácido –arginina + piruvato = octopina –arginina + a-ketoglutaraldeído = nopalina –glutamato bicíclico = agropina Catálise de opinas –no Ti, mas fora região T-DNA –específico para a cepa indutora do tumor

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20 Agrobacterium Região vir genes responsáveis pela síntese de enzimas da transferência e integração do T-DNA –transporte do ssT-DNA-membranas e paredes –proteção contra nucleases região de Kb 8 operons: virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG e virH 25 genes virA, virF e virG - monocistrônicos outros –policistrônicos animação

21 Agrobacterium Região vir sistema regulador positivo: virA e virG regulam os outros genes vir VirA: expresso constitutivamente –proteína de membrana interna - histidina kinase –reconhece compostos fenólicos sob pH 5-5,8 –auto-fosforilação e fosforilação de VirG VirG - fosforilado se torna ativo –ativa sua própria transcrição –ativa transcrição outros genes vir –seqüência de 12 pb - vir box

22 Agrobacterium Região vir virC e virD - geração e processamento do T-DNA reconhecem borda direita do T-DNA –virD1:- relaxamento da fita dupla (topoisomerase) –virD2:- corte da fita simples (endonuclease) e formação de complexo-T com o ssT-DNA e direcionamento –virC1 e virC2: complementam atividade de virD1 e virD2 virB e virE - formação de elementos estruturais de movimento do T-DNA –virE2: proteína do tipo single strand binding ptn) protegendo T-DNA de degradação por nucleases e direcionamento –virB1 a virB11: formação de tubo de conjugação –virH (ou pinF): responsável desintoxicação (tipo citocromo)

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24 Agrobacterium Região vir mutações em virA, virB, virD e virG : eliminam formação de tumores mutações de virC, virE, virF e virH: restringem gama de hospedeiro animação

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26 Agrobacterium Região vir é suficiente para transferir qualquer T- DNA - reconhece bordas Gene indutores de tumores podem ser retirados e substituídos no T-DNA

27 Geração de Linhagens de Agrobacterium Desarmadas Remoção de oncogenes

28 Sistema de vetores de Agrobacterium para transformação A. Co-integrado B. Binário

29 Plasmídeo Binário

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31 Cruzamento Triparental Agrobacterium e Escherichia com auxílio pRK2013 helper

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33 Agrobacterium Genoma seqüenciado C58: bases cromossoma circular: – pb (59,4% G+C) ptn cromossoma linear: – pb (59,3% G+C) ptn plasmídeo pAtC58: – pb (57,3% G+C) ptn plasmídeo pTiC58: – pb (56,7% G+C) ptn

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35 Bombardeamento com Micropartículas micropartículas cobertas com DNA construído, acelerados por explosão, introduzidos em células vegetais Vantagens: 1. transformação de Monocot e Legumes 2. simplificação nas construções 3. co-transformação com várias construções 4. ausência de falsos positivos 5. protocolos de transformação simplificados

36 Transformação por Bombardeamento

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44 Métodos Alternativos 1. Fibra Silicon Carbide - fibras penetram parede celular com DNA aderido - cristais únicos 0,6 x 10 a 80 mm - suspensões celulares - milho, aveia e tabaco - simples e flexível - domínio público 2. Eletroporação de tecidos intactos - expressão transiente em pólen de tabaco, base de folha de cereais, embriões de caupi - transformação estável em sementes - padronização de equipamento - capacitor

45 3. Eletroforese - embrião de cevada e orquídeas 4. Microinjeção - rotina para célula animais - utiliza micromanipulador - uso de protoplasto - vacúolo - oneroso, complexo e demorado

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47 Transformação de Plantas Introdução de genes heterólogos Alteração da expressão gênica –superexpressão promotor constitutivo ou induzível –gene anti-senso ou senso - silenciamento Aplicações –Melhoramento genético –Plantas como biorreatores –Estudo de função

48 Tipos de genes 1. Genes estruturais codificam enzimas 2. Genes regulatórios codificam proteínas que controlam genes estruturais (fatores de transcrição) ->definem QUANDO, QUANTO e ONDE

49 Promotor Gene Estrutural Região Codificadora de Proteína Regulatório R R R Enzima Gene Estrutural

50 Estratégias de Modificação de Rotas Metabólicas INTRODUÇÃO DE GENE codificando enzima não existente ou não funcional ou pouco eficiente gene sentido oposto - ANTISENSO –GENE -> ENEG gene com controle alterado (promotor)

51 Reação em Rotas Metabólicas ABCD Xyu E z

52 Gene em Senso e Antisenso Promotor GGCAAGCT ENEG Senso Promotor GENE AGCTTGCC Antisenso

53 Rota Metabólica de Biossíntese ABCD Xyu E z Reação Normal Produtos D e E feitos

54 Rota Metabólica de Biossíntese Introdução de novo gene ABC D X yu E z Introdução de gene w codificando enzima W Produtos D e W feitos W W transformação

55 Reação em Rotas Metabólicas Antisenso A B C D Xyu E z Introdução de gene y anti-senso inibindo Y Produtos D e E não são feitos transformação

56 Reação em Rotas Metabólicas: Ex. resistência à herbicida X Y Z Amino Ácidos EPSPS Enzima fundamental para sintetizar um grupo de amino ácidos Roundup inibe EPSPS Carência de Aminoácidos Planta morre

57 Soja RoundupReady X Y Z Amino Ácidos EPSPS CP4-EPSPS Forma da enzima que NÃO é inhibida por Roundup Bypass Metabólico Adicionando gene codificando EPSPS que permite as plantas fazer amino ácidos após aplicação de Roundup


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