Vaccinia Virus E2L Null Mutants Exhibit a Major Reduction in Extracellular Virion Formation and Virus Spread Arban Domi, Andrea S. Weisberg, and Bernard.

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1 Vaccinia Virus E2L Null Mutants Exhibit a Major Reduction in Extracellular Virion Formation and Virus Spread Arban Domi, Andrea S. Weisberg, and Bernard Moss* Laboratory of Viral Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-3210 Received 7 January 2008/Accepted 12 February 2008 Grupo: Gabriel Gonçalves Gabriel Nascimento Lays Souza Taís Azevedo

2 Vírus Vaccinia Família: Poxviridae Gênero: Ortopoxvirus; Espécies: Vaccinia Virus; Doença: cowpox, vaccinia, smallpox. VACV mesma família vírus da varíola. cepas do vírus vaccinia foram utilizadas na vacinação contra varíola. Edward Jenner em 1796 descoberta da propriedade de imunização. Microscopia eletrônica do vírus vaccinia CRIAÇÃO DA PRIMEIRA VACINA!!

3 VACV é capaz de iniciar uma resposta imune protetora contra o vírus da varíola. Cepas selvagens desse vírus têm sido identificadas em surtos, causando lesões em vacas leiteiras e nos trabalhadores rurais que cuidam desses animais no Brasil e também em partes sa Ásia. Vaccinia Bovina Varíola foi declarada oficialmente erradicada pela OMS em 1980 O achado de anticorpos em pacientes nascidos após a campanha de erradicação da varíola indicaria que, de alguma forma, estes indivíduos tiveram contato com amostras virais selvagens.

4 O desconhecimento de médicos e laboratórios é uma das principais ameaças.

5 E2 é sintetizado tardiamente na infecção Pra determinar o tempo de expressão do gene E2L ORF em células infectadas, produzimos o anticorpo policlonal de coelho para o peptídeo n-terminal predito. A banda reativa migrou sensivelmente mais rápido que a predita e foi resolvida por western blot de lisados de células infectadas, mas não em lisados de células não-infectadas ou células infectadas com o mutante de E2L (que tem esse gene deletado).

6 E2 é sintetizado tardiamente na infecção O timing da síntese de E2 e o efeito de AraC sugerem que o E2L ORF tem um promotor de estágio intermediário ou tardio. Afim de determinar se promotor de E2L é Tardio ou Intermediário, plasmídeos contendo os dois tipos de promotores foram incubados na presença (+) ou ausência (-) de araC.

7 E2 é presente em virions purificados Quantidades iguais de MVS e EVs (determinado pela densidade ótica e confirmada pela coloração de prata de um gel de poliacrilamida-SDS) foram analisados por Western blot utilizando anticorpos contra proteínas que estão presentes igualmente em MVS e EVs ou predominantemente em um ou outro. Notamos E2 relativamente mais em EVs purificada a partir do meio do que em MVs isoladas de células.

8 Deleção do gene E2L resulta num fenótipo de Placas reduzidas Para confirmar se o fenótipo da placa pequena deveu-se à supressão E2L e não a uma mutação em outras partes do genoma VACV, DNA contendo o gene E2L intacta e região de acompanhamento foi transfectado em células infectadas com vVAC-BAC E2L. Um vírus recombinante formando placas de tamanho normal.

9 Deleção do gene E2L resulta num fenótipo de Placas reduzidas

10 O fenótipo de placas reduzidas não foi específico de tipos celulares.

11 Formação de vírus extra e intracelular

12 Montagem Viral

13 Conclusão Concluiu-se provisoriamente que o promotor E2L é um promotor intermediário atípico fraco. Seria interessante aumentar a força do promotor por engenharia genética para ver se a expressão elevada é prejudicial e se regulação poderia ocorrer por mutação espontânea. Mais estudos são necessários para determinar o papel da proteína E2 na formação EV.