Biologia Molecular Básica e Aplicada Primeira Oficina de Trabalho das Redes Nacionais de Laboratórios Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini Pesquisadora do Depto. de Clínica Médica da FMB Responsável pelo Lab. de Biologia Molecular do Hemocentro-Botucatu

Dogma Central da Biologia Molecular DNA RNA Proteína

AS PROTEÍNAS DO HLA

RECEPTORES DE CITOCINAS

A ESTRUTURA DO DNA Duas cadeia antiparalelas, dispostas em dupla hélice.

A ESTRUTURA DO DNA NH2 N O -O P O CH2 O- C4´ C1´ C3´ C2´ OH H FOSFATO AÇÚCAR BASE NITROGENADA NUCLEOTÍDEO

A ESTRUTURA DO DNA A - T C - G Adenina (A) Timina (T) Bases Nitrogenadas A - T C - G Adenina (A) Timina (T) Guanina (G) Citosina (C)

Duplicação do DNA

- - - O C4´ C1´ C3´ C2´ OH H O C4´ C1´ C3´ C2´ OH H O C4´ C1´ C3´ C2´

Reação em cadeia da Polimerase PCR DNA genômico Taq polimerase Primers Tampão dCTP dATP dGTP dTTP 72ºC 30 s 57ºC 30 s 94ºC 5 min

REVELAÇÃO

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (mimetiza a duplicação) TRANSCRIÇÃO REVERSA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE RT-PCR PREPARO DAS AMOSTRAS DETECÇÃO TRANSCRIÇÃO REVERSA PCR PROPRIAMENTE DITO (mimetiza a duplicação)

Transcrição (DNA-RNA) (Expressão do gene)

TATA box: -25 a -30 bp acima do início do sítio de transcrição. TFIID: fator de transcrição geral que liga-se ao TATA box. Contém 2 tipos de sub-unidades TATA binding protein (TBP): liga-se ao TATA box e a TAFs. TBP-associated factors (TAFs): 10-12 proteínas que ligam-se ao TBP. TFIIB: liga o complexo TFIID à RNA polymerase. TFIIF: liga a RNA polymerase ao TFIID. TFIIE and TFIIH: liga-se ao complexo enzimático e inicia a transcrição. Seqüência iniciadora (Inr): está presente em alguns genes e ajuda no alinhamento do complexo. A Inr liga-se aos TAFs.

Domínios dos fatores de transcrição Domínio de ligação ao DNA: ancora o FT ao sítio correto no promotor ou no enhancer. Domínio de ativação: estimula a transcrição por interação com outros FTs como os TAFs.

Os hormônios esteróides difundem-se pela membrana e ligam-se a receptores citoplasmáticos que estimula a transcrição de genes alvo

A ligação do hormônio ao receptor promove a interação desse receptor a uma proteína G. A sub-unidade alfa da proteína G estimula a adenil ciclase, que cataliza ATP  AMP cíclico O cAMP liga-se à proteína quinase A que, no núcleo, fosforila o fator de transcrição CREB (CRE-binding protein). CRE = elemento respondedor de cAMP

TRANSCRIÇÃO

Ciclo de vida de um mRNA

TRANSCRIÇÃO

TRANSCRIÇÃO REVERSA RNA cDNA DNA TR RNASE H TR

AMPLIFICAÇÃO BASEADA NA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS NASBA LIBERAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO ISOLAMENTO DETECÇÃO AMPLIFICAÇÃO (mimetiza a transcrição)

NUCLEIC ACID SEQUENCE BASED AMPLIFICATION NASBA NUCLEIC ACID SEQUENCE BASED AMPLIFICATION DETECÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO LIBERAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO ISOLAMENTO DO ÁCIDO NUCLEICO AMPLIFICAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO

LIBERAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO 1 ML DE PLASMA TAMPÃO DE LISE ISOLAMENTO DO ÁCIDO NUCLEICO

ISOLAMENTO DO ÁCIDO NUCLEICO SÍLICA CALIBRADORES Qa, Qb, Qc LAVAGENS ELUIÇÃO DO RNA

AMPLIFICAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO PRIMER RNA ELUÍDO ENZIMAS 410 C

410 C I S O T É R M C

ELETROQUIMIOLUMINESCÊNCIA LUZ EMITIDA PELAS SONDAS QUANTIDADE DE AMOSTRA AMPLIFICADA

LEITURA

LEITURA

Tradução RNA-Proteína

HIBRIDIZAÇÃO DAS SONDAS E DAS MOLÉCULAS AMPLIFICADORAS DO SINAL I. Introdução Progressão da Infecção pelo HIV -1 DNA- RAMIFICADO BRANCHED-DNA PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DETECÇÃO HIBRIDIZAÇÃO DAS SONDAS E DAS MOLÉCULAS AMPLIFICADORAS DO SINAL Ministério da Saúde, 1998

CARGA VIRAL PLASMÁTICA TRÊS METODOLOGIAS COMERCIAIS DISPONÍVEIS I. Introdução Progressão da Infecção pelo HIV -1 CARGA VIRAL PLASMÁTICA TRÊS METODOLOGIAS COMERCIAIS DISPONÍVEIS RT-PCR NASBA BRANCHED-DNA Mini

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