HIV X Imunoterapia Fernanda Rocha Gustavo Garcia Tiago Medina

HIV- Vírus da Imunodeficiência Humana HIV- (human imunodeficiency virus): Familia: Retroviridae Gênero: Lentivirus HIV-1 – (Subtipos de A-J) HIV-2 Sintomas: Semelhante gripe comum Partículas do HIV-1 na superfície de macrófagos infectados

Eastern Europe & Central Asia South & South-East Asia Total: 33.3 million [31.4 million – 35.3 million] Western & Central Europe 820 000 [720 000 – 910 000] Middle East & North Africa 460 000 [400 000 – 530 000] Sub-Saharan Africa 22.5 million [20.9 million – 24.2 million] Eastern Europe & Central Asia 1.4 million [1.3 million – 1.6 million] South & South-East Asia 4.1 million [3.7 million – 4.6 million] Oceania 57 000 [50 000 – 64 000] North America 1.5 million [1.2 million – 2.0 million] Central & South America [1.2 million – 1.6 million] East Asia 770 000 [560 000 – 1.0 million] Caribbean 240 000 [220 000 – 270 000] População infectada com HIV

Eastern Europe & Central Asia South & South-East Asia Estimativa de novos casos de infecção pelo HIV Western & Central Europe 31 000 [23 000 – 40 000] Middle East & North Africa 75 000 [61 000 – 92 000] Sub-Saharan Africa 1.8 million [1.6 million – 2.0 million] Eastern Europe & Central Asia 130 000 [110 000 – 160 000] South & South-East Asia 270 000 [240 000 – 320 000] Oceania 4500 [3400 – 6000] North America 70 000 [44 000 – 130 000] Central & South America 92 000 [70 000 – 120 000] East Asia 82 000 [48 000 – 140 000] Caribbean 17 000 [13 000 – 21 000] Total: 2.6 million [2.3 million – 2.8 million]

Cinética da infecção pelo HIV Abaixo de 200 células/ml: Muito vulnerável, tratar imediatamente; Entre 200 e 350 células/ml: Vulnerável, deve ser iniciado o tratamento Entre 350 e 500 células/ml: Pouco vulnerável, pode começar a critério médico; Acima de 500: Saudável, não precisa começar o tratamento.

Formas de terapias para o controle da infecção viral Nature Biotechnology 25, 1395 - 1402 (2007)/ Ann Intern Med. 1996 Apr 1;124(7):654-63.

Sistema Imune versus Infecção Viral The first systemically detectable immune responses to HIV-1 infection are the increases in levels of acute-phase proteins in the plasma, which are observed when virus replication is still largely restricted to the mucosal tissues and draining lymph nodes (eclipse phase). When virus is first detected in the plasma (T0), broad and dynamic increases in plasma cytokine levels are also observed. Within days, as plasma viremia is still increasing exponentially, the first antibody–virus immune complexes are detected. Expansion of the earliest HIV-1-specific CD8+ T cell responses also commences prior to peak viraemia, followed by detection of the first free glycoprotein (gp)41-specific but non-neutralizing IgM antibodies. Complete virus escape from the first CD8+ T cell responses can occur rapidly, within 10 days of T cell expansion. By this time, viral reservoirs exist, possibly becoming established within days of infection. The earliest autologous-virus-neutralizing antibodies are detected around day 80 following infection, as viral loads are still declining prior to the onset of the viral set point. Antibody escape virus mutants emerge in the plasma within the following week. Nature Reviews Immunology 10, 11-23 (January 2010)

Propagação do HIV

Pontos de intervenção por drogas antivirais Nature Biotechnology 25, 1395 - 1402 (2007)

Resposta imune durante infecção viral

-100µg/kg de IL7 por 9 dias IL-7: envolvidas na sobrevivência das células B, T e NK; sintetizada no estroma da medula óssea Il15 é importante para manutenção CD8 memoria. Each line represents individual animals treated with 50 g/kg/d (red), 200 g/kg/d (blue), and 500 g/kg/d (green). Thus, we treated rhesus macaques with moderate CD4 depletion due to infection with simian immunodeficiency virus with rhIL-7 (100 g/kg/d for 9 days).

-ATR+ 100µg/kg de IL7 por 26 dias were treated with ART plus 100 g/kg rsIL-7 every other day for 26 days (dark gray area). The bola branca indicate changes in viral load, and bola preta and quadrado preto correspond to counts of CD4 and CD8 T cells, respectively

8dpi – 10µg de IL7 ou PBS por 2 semanas Eight days after infection, we injected mice subcutaneously once daily with 10 mg of recombinant human IL-7 (Cytheris) or PBS for 2 weeks. (a) In vitro cell survival of in vivo–activated LCMV-specific P14 CD8+ and Smarta CD4+ T cells treated with IL-7 or PBS in culture. (c) Ex vivo cytolytic killing of GP-33 or control adenovirus peptide (AV)–pulsed targets by PILs from LCMV-vaccinated, tumor-bearing mice after 7 d of IL-7 or PBS treatment Cytotoxic T lymphocyte assays. We incubated EL-4 target cells with GP33 ou AV

-3 ou 10 μg/kg de IL-7; 3x/semana por 16 dias Patients received a total of 8 subcutaneous injections of 2 different doses of recombinant human IL-7 (rhIL-7; 3 or 10 μg/kg) 3 times per week over a 16-day period. rhIL-7 was well tolerated and induced a sustained increase of naive and central memory CD4+ and CD8+ T cells.

IL-7 administration drives T cell-cycle entry and expansion in HIV-infection Objetivo: Verificar a atividade biológica da IL-7 recombinante humana administrada em pacientes infectados com HIV.

A rhIL-7 é tóxica para pacientes infectados com HIV? 1 4 14 28 56 rhIL-7/ placebo toxicidade Teste para anticorpos anti-IL-7 A concentração de 30 mg/kg de rhIL-7 é a máxima tolerada pelos pacientes.

Qual o perfil farmacocinético da rhIL-7 após seu único inóculo subcutâneo? Dose única 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 4, 8, 12, 24, 48 e 72h plasma ELISA Os níveis de IL-7 no plasma aumentaram de modo dependente da dose. O perfil farmacocinético torna-se não linear com o aumento da dose.

Uma única dose de IL-7 induziu um aumento no número de Como os linfócitos circulantes se comportam após administração de rhIL-7? rhIL-7 Dose única 0, 1, 2, 4, 14, 28 dias PBMC Citometria de Fluxo Placebo IL-7 (3mg/Kg) IL-7 (10mg/Kg) IL-7 (30mg/Kg) IL-7 (60mg/Kg) Uma única dose de IL-7 induziu um aumento no número de linfócitos T CD4+ e CD8+ circulantes.

O aumento de linfócitos foi predominante entre os A administração da IL-7 induziu o aumento linfocitário de alguma sub-população específica? rhIL-7 Dose única 0, 1, 2, 4, 14, 28 dias PBMC Citometria de Fluxo O aumento de linfócitos foi predominante entre os linfócitos T de memória central.

A administração de rhIL-7 induz proliferação de linfócitos? Dose única Ki67  proteína nuclear expressa em todas as fases do ciclo celular, exceto na fase de repouso 0, 1, 4, 14, 28 dias Linfócitos Proliferação celular Placebo IL-7 (3mg/Kg) IL-7 (10mg/Kg) IL-7 (30mg/Kg) IL-7 (60mg/Kg)

rhIL-7 induz proliferação e ativação de linfócitos? Treg A administração de rhIL-7 induziu os linfócitos T a entrarem em ciclo celular, exceto a subpopulação de células T reguladoras.

A administração de rhIL-7 induz ativação de linfócitos? Dose única 0, 1, 4, 14, 28 dias Linfócitos Ativação celular Placebo IL-7 A administração de rhIL-7 induziu ativação dos linfócitos T no mesmo período que eles iniciaram ciclo celular.

Qual o efeito da rhIL-7 sobre as células T CD8+ específicas ao antígeno viral? Dose única Tetrâmero + Peptídeos Citomegalovirus; Epstein-Barr virus; Influenza virus; HIV 0, 4, 28 dias PBMC Citometria de Fluxo Uma única dose de rhIL-7 aumentou o recrutamento não seletivo de células T CD8+ de memória específicas ao antígeno em ciclo celular.

O número de células B circulantes não foi alterado Qual o efeito da rhIL-7 sobre os linfócitos B? B CD10 CD21low CD21high Imatura Transição IL-7 rhIL-7 Dose única 0, 4, 28 dias PBMC O número de células B circulantes não foi alterado Citometria de Fluxo A administração de rhIL-7 induziu a emergência de células B de imaturas para uma fase de transição.

CD8 D8 IL-7 CD4 Treg Memória central IL-7 IL-7 IL-7 IL-7 IL-7 IL-7 IL-7 3-30mg/kg B Imatura CD10 Transição IL-7 A IL-7 possui um perfil favorável para o desenvolvimento terapêutico para pacientes com HIV ou outras linfopenias.

Objetivo: Investigar o potencial terapêutico da IL-7 na infecção crônica pelo LCMV, na tentativa de reverter a exaustão celular.

Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas O tratamento com IL-7 aumenta o número de células no baço durante a infecção com LCMV? Infecção com o clone 13 - LCMV C57BL/6 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas Quantificação do número de células no baço em diferentes dias Houve aumento de linfócitos T CD4, T CD8 e linfócitos B após tratamento com IL-7

A IL-7 promoveu o aumento de células T CD8 específicas para o LCMV O tratamento com IL-7 aumenta o número de células T CD8 específicas para o LCMV? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas Remoção do baço (Marcação com tetrâmero) Citometria – células TCD8 específicas para TetGP33+, TetGP276+ e TetNP396+ A IL-7 promoveu o aumento de células T CD8 específicas para o LCMV

O aumento no número de células também é observado em outros órgãos? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas Fígado 29° dia Histologia do fígado Citometria para TCD4 e TCD8 totais e específicas para os tetrâmeros Após o tratamento com IL-7, houve aumento no infiltrado de células totais e específicas para o vírus no fígado, cérebro, pulmões e rins

As células T CD4 e TCD8 expandidas pela IL-7 são funcionais. O aumento no número de células obtidas após o tratamento com IL-7 se traduz em ganho funcional? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas 29° dia Citometria – células TCD4 e TCD8 específicas para o vírus As células T CD4 e TCD8 expandidas pela IL-7 são funcionais.

Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas ... Células T de camundongos infectados com o clone 13 de LCMV possuem altos níveis de PD-1 (Barber et al., 2006). Os níveis de PD-1 nas células T estão diminuídos após o tratamento com IL-7? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas 29° dia FACS - Expressão de PD-1 nas células TCD4 e TCD8 O tratamento com IL-7 diminuiu a expressão de PD-1 nas células T CD4 e T CD8

Camundongos tratados com IL-7 eliminam eficientemente o vírus? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas Titulação viral em vários dias – Contagem de placa viral A IL-7 facilitou a eliminação viral dos reservatórios crônicos (baço, fígado, rins e cérebro)

Quais citocinas estão elevadas durante o tratamento com IL-7? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas Dosagem de citocinas séricas - ELISA Citocinas do padrão Th1 e Th17 estão aumentadas durante o tratamento com IL-7. IL-10 aumenta após a eliminação do vírus

O tratamento com IL-7 induz dano tecidual decorrente da resposta imune inflamatória? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas Dosagem de AST e ALT no soro O tratamento com IL-7 não aumenta os níveis séricos das enzimas indicativas de dano hepático

A produção de IL-22 está aumentada durante o tratamento com IL-7? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas 29° dia Dosagem de IL-22 no soro - ELISA O tratamento com IL-7 também aumenta a produção sérica de IL-22

O dano hepático limitado foi consequência do efeito citoprotetor da IL-22? A IL-22 produzida durante o tratamento com IL-7 impede os danos celulares no fígado

O tratamento com IL-7 altera o número de células T reguladoras? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 3 semanas FACS – Tregs no baço e no fígado O número absoluto de Tregs aumenta após o tratamento com IL-7, mas a frequência está diminuída em relação ao número total de células T

A depleção de Tregs durante o tratamento com IL-7 altera o número de células T totais e específicas para o LCMV? A depleção de Tregs aumentou o número de células T CD4 e T CD8 totais e específicas para o vírus.

Dosagem de citocinas no soro O aumento de células T em animais depletados de Tregs está relacionado com aumento de IL-2? Dosagem de citocinas no soro A maior produção de IL-2 induzida pelo tratamento com IL-7 promove o aumento no número de células T.

A depleção de células T reguladoras não provocou danos hepáticos A depleção de Tregs durante o tratamento com IL-7 provocou danos hepáticos? Dosagem de AST no soro A depleção de células T reguladoras não provocou danos hepáticos

Socs3 é expresso durante a infecção crônica por LCMV? Infecção crônica com o clone 13 - LCMV Infecção aguda - cepa Armstrong de LCMV OU Sorting das células T Western Blotting – Expressão de Socs3 Socs3 é altamente expresso na infecção crônica causada por LCMV

O tratamento com IL-7 inibe a expressão de Socs3 durante a infecção crônica por LCMV? Infecção com o clone 13 - LCMV 8° dia Tratamento com IL-7 ou PBS por 5 dias Sorting das células T Western Blotting – Expressão de Socs3 A expressão de Socs3 nas células T foi inibida após tratamento com IL-7

Socs3 é o principal inibidor da resposta imune contra a infecção crônica por LCMV? Infecção com o clone 13 - LCMV Infecção com o clone 13 - LCMV Socs3wt/wtLck-Cre- Socs3fl/flLck-Cre+ Remoção do baço FACS – Células TCD8 específicas para NP396, GP276 e GP33 Socs3 inibe a resposta imune específica contra o LCMV

As células T permanecem funcionais após a deleção condicional de Socs3? Infecção com o clone 13 - LCMV Infecção com o clone 13 - LCMV Socs3wt/wtLck-Cre- Socs3fl/flLck-Cre+ Remoção do baço FACS – Células TCD4 e TCD8 produtoras de citocinas As células T CD4 e TCD8 continuam funcionais na ausência de Socs3

O vírus é eliminado de órgãos reservatórios na ausência de Socs3? A deficiência de Socs3 propiciou a eliminação viral de vários órgãos reservatórios

Conclusão