Fraccionamento/Separação Celular

Células Sanguíneas

Células do Sistema Imune Macrofagos Monócitos Neutrófilos PMN Eosinófilos Basófilos Linfócitos T B NK CD4 CD8

- Células sem núcleo ou outros organelos - Eritrocitos (RBC) - Células sem núcleo ou outros organelos Sobrevivem em circulação ate 120 dias Constituídos por hemoglobina (90%) e de forma bicôncava Plaquetas (platelets) Células homeostáticas para a coagulação sanguínea, responsáveis pela libertação de substancias vaso constritoras Polimorfonucleados = Eosinofilos + basofilos + neutrofilos Formam-se na medula óssea têm uma vida de 3 a 4 h após a qual se fixam nos tecidos São atraídos para tecidos inflamados/infectados por factores quimiostáticos. Matam envolvendo o agente infeccioso e libertando os grânulos citoplasmáticos (mieloperoxidase) Importância destacada nas reacções alérgicas agudas e crónicas

- NK - células natural killer - Macrofago Célula fagocitaria derivada do monocito Exerce funções no sistema imunitário inato e adquirido Estão presentes nos pulmões, baço, fígado, e nódulos linfáticos onde, grosso modo, combatem bactérias, vírus, e protozoários intracelulares. - NK - células natural killer - Sao linfócitos largos e granulares que não expressam IG ou receptores T mas são capazes de reconhecer e destruir células tumorais ou infectadas por vírus.

Linfocitos Células especializadas no reconhecimento dos antigénios Dividem se em dois tipos: - Células B – desenvolvem-se na medula óssea e diferenciam se em células produtoras de anticorpos, imunoglobulinas (IG) - imunidade humoral - Células T - diferenciam-se no timo e nas suas funções incluem apoiar células B na produção de IG e actividade microbicida quer por contacto celular directo ou pela libertação de citoquinas - imunidade celular CD4 células helper (Th) CD8 citotóxicas (Tc)

Separação de células sanguíneas Centrifugação Panning Separação imunomagnética Cromatografia de afinidade Citometria de fluxo FACS (fluorescence-activated cell sorter)

Separação pela aplicação de força centrifuga elevada (600 mil x g) Centrifugação A suspensão de células vai ter partículas com diferentes - tamanho - carga - densidade Separação pela aplicação de força centrifuga elevada (600 mil x g) Aplicações: técnica preparativa para separar um dado componente para estudo técnica analítica para determinar propriedades físicas (pm; densidade, forma) ou pesquisar a presença de macro moléculas

Centrifugação Diferencial Envolve a separação do material solúvel entre o material celular insolúvel A força centrífuga e o tempo de centrifugação são ajustadas de forma a assegurar que o material insolúvel fica no pellet e o material solúvel (proteínas) fica no sobrenadante Ex: sangue/plasma Centrifugação em Gradiente Envolve a separação de partículas com base na sua massa e forma mas numa solução de densidade (de sacarose) e/ou de concentração (de sais) crescente A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a centrifugação migram de acordo com a sua velocidade de sedimentação

Separação de linfócitos em gradiente de densidade Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentar EX: centrifugação de gradiente de Ficoll-Hypaque Ficol: polisacarideo Agrega eritrócitos tornando-os mais densos Metrizamida (composto denso contendo iodo) Densidade ajustável em função da concentração

Eritrócitos + leucócitos polimorfonucleares (granulócitos) – mais densos Células mononucleares (linfócitos + monócitos) – menos densos - recuperados à superfície Soro plaquetas Células mononucleares Ficoll-hypaque density

PANNING Aderência celular a uma superfície sólida Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes (medula óssea) Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados (anti IG- separam B de T)

Separação Imunomagnética forma rápida de separação de grandes quantidades de linfócitos acoplamento de esferas magnéticas a anticorpos monoclonais que reconhecem moléculas da superfície das células os anticorpos acoplados às esferas magnéticas, são misturados com as células a separar. A mistura passa por uma coluna magnética, que reterá as células ligadas ao anticorpo

Separação Imunomagnética

Cromatografia Princípio: As moléculas dissolvidas numa solução podem associar-se ou dissociar-se de uma superfície sólida. Se a solução se mantiver em fluxo as moléculas podem-se separar de acordo com as interacções com o suporte Em coluna

Cromatografia de afinidade Baseada na capacidade de uma proteína/componente se ligar especificamente a outra partícula (anticorpo) As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a anticorpos específicos da proteína de interesse – coluna de imunoafinidade As partículas são depois eluídas por ex. por uma solução concentrada de ligando, pH diferente do de ligação.

Fluorescence-activated cell sorter FACS Fluorescence-activated cell sorter Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas dierentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8) Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente. O citómetro de fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser

Purificação positiva e negativa Purificação Positiva (as células são separadas por apresentarem uma dada característica) Purificação Negativa Panning Imuno-separação magnética Centrifugação gradiente densidade Formação de rosetas (Linf T/B) Citometria de Fluxo Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento (Linf T CD4/CD8) RIA (Radioimmunoassay) ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Preservação Tecidos (sangue, medula ossea, outros tecidos linfoides) - Criopreservação - 80 ºC (3 meses; perda progressiva das características) Células (culturas celulares, células previamente separadas) - Crioprotecção - 40 ºC (semanas) - 80 ºC (anos) No caso dos linfócitos ocorrem sempre algumas alterações ao nível das moléculas de superfície (fenotipagem antes da utilização)