Métodos de Dosagens de Anticorpos

Apresentação em tema: "Métodos de Dosagens de Anticorpos"— Transcrição da apresentação:

1 Métodos de Dosagens de Anticorpos
Prof. Adriane Martins Dias

2 Métodos Muitas técnicas de laboratório baseiam-se no uso de anticorpos. O método laboratorial que utiliza anticorpos têm grande importância por ser possível produzir anticorpos contra qualquer tipo de molécula e composto químico.

3 Métodos Principais técnicas que utilizam anticorpos para identificação clínica: A) Imunoensaios Radioimunoensaios e Ensaio de imunoabsorção por Ligação Enzimática. B)Purificação e Identificação de Proteínas Imunoprecipitação e Cromatografia por afinidade. Western Blot

4 Métodos C) Marcação e Detecção de Antígenos em células/tecido
Citometria de Fluxo Imunoflorescência e Imuno-histoquímica D) Medição de Interação Antígeno/Anticorpo E) Técnicas que fazem análise da estrutura e da expressão gênica. PCR

5 Métodos Imunofluorescência:
Primeira técnica utilizada foi a Imunofluorescência Direta. Nesta técnica se pesquisa um antígeno em uma reação com anticorpo preparado com fluorocromo. São utilizados anticorpos purificados específicos para um determinado antígeno ou grupo de antígenos conjugados com um fluorocromo.

6 Métodos Imunofluorescência Direta

7 Métodos É chamada de técnica de camada simples.
Imunofluorescência Indireta (dupla camada): Antígenos são fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente e por isso coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno.

8 Métodos Nesta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários para diferentes tipos de antígenos. Nesta técnica o antígeno fica entre dois anticorpos. Técnica é aplicada para estudar tecidos linfoides e descobrir que tipo de anticorpos está sendo produzido.

9 Métodos Imunofluorescência Indireta

10 Métodos Imunoenzimático: ELISA
Se baseia na identificação de anticorpos e ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima. Essa enzima irá agir sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor. Produto da reação, além de colorido, é insolúvel para não difundir no local da formação.

11 Métodos ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) – Ensaio de Imunoabsorção ligado a enzima)

12 Métodos Reação é desenvolvida, frequentemente, em microplacas contendo vários poços onde são depositados os reagentes. Método Direto ou Sanduiche Usado para identificação de antígenos, e esse antígeno fica entre dois anticorpos. O anticorpo de um antígeno particular é inicialmente adsorvido a placa.

13 Posteriormente o antígeno (soro, urina ou solução contendo o antígeno), é adicionado, e se liga ao anticorpo. Seguidamente um segundo e diferente anticorpo ligado a enzima é adicionado. A intensidade da reação é proporcional a quantidade de antígeno presente, permitindo se mensurar até pequenas quantidades de antígeno.

14 Método ELISA (Método Indireto) – Utilizado para detecção de anticorpos. O antígeno fica aderido aos poços da microplaca. Em seguida, coloca-se o soro problema e posteriormente um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor.

15 Métodos A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor confirma a ausência do anticorpo em questão. Enzimas: São elas que convertem um substrato sem cor em um produto de cor. Enzima mais utilizada é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento de H2O2 em H2O mais O2.

16 Interpretação dos resultados:
A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato é proporcional a quantidade de anticorpos (específicos para o antígeno) presentes no soro. A intensidade pode ser analisada por um espectrofotômetro (Leitor de Elisa) permitindo uma análise quantitativa.

17 Métodos ELISA ( Método Indireto)

18 Métodos ELISA

19 Métodos Radioimunoensaio:
Pequenas quantidades de anticorpos ou antígenos podem ser detectadas depois de marcadas com isótopos radioativos. É uma reação de imunológica onde temos um aumento da especificidade. Não ocorre perda de características físicas, químicas e biológicas das moléculas marcadas com os compostos radioativos.

20 Métodos Citometria de Fluxo:
É uma técnica que tem como particularidade a análise rápida, quantitativa e multiparamétrica de uma célula individual (viva ou morta), entre diversas células de uma população. É frequentemente empregado para investigar a expressão de certas moléculas intracelulares ou moléculas de membrana.

21 Métodos São utilizados anticorpos marcados com fluorocromo e a análise dos parâmetros é mensurada por meio da intensidade de fluorescência produzida por esses marcadores.

22 Métodos Citômetro

23 Métodos