Disciplina: Seminário I UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA Disciplina: Seminário I Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA Abordagem Proteômica e a Identificação de Biomarcadores de Processos Fisiológicos Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

INTRODUÇÃO Estrutural Seres vivos Enzimática Transporte Hormonal Proteínas Imunológica

ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS INTRODUÇÃO Anderson & Anderson (1982) ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS

Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995) A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições.

Dinâmica do proteoma Fatores epigenéticos Temperatura Estresse Doenças Alimentação WITZMANN & LI (2002) DNA Transcrição Splicing pré-RNAm RNAm Modificações Tradução Degradações Proteínas

OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA Nível de expressão de proteínas Modificações Pós-traducionais Proteômica Interações entre proteínas Identificação de Biomarcadores

BIOMARCADORES São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos. Moore et al., (2007)

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Coleta Coleta Amostra Separação Identificação ZHOU et al., (2005)

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Coleta de amostras: Unicelulares (+ sincronização): fase do ciclo celular e condições de cultivo Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares (- sincronização): Biópsias: ≠ tipos celulares Cultura de tecidos Coleta: Manual X microdissecção a laser Fluídos biológicos Complexidade

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Eletroforese Bidimensional (2D) Espectrometria de Massa (EM) Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos; Quantitativos Qualitativos Cromatografia líquida (CL) Espectrometria de massa (EM) Recuperação de ptns na forma nativa Análises funcionais, estruturais e bioquímicas

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob a influência de um campo elétrico: 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica pI 2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE) Tamanho (massa molecular) O’Farrell, 1975; Gorg et al. 1998

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (+) (maior) M.M. pI (-) (menor) Focalização Isoelétrica SDS-PAGE

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (maior) M.M. (menor) SDS-PAGE

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL pI (-) (+) Revelação Azul brilhante de Coomassie coloidal Fluorescência (+) M.M. Análise do gel (-)

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL Gel A controle ≠ Gel B Tratamento ISSAQ & VEENSTRA (2008)

ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE) Cy5 controle Cy5 Tratamento UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)

Tabela 1. Vantagens e limitações da eletroforese bidimensional. Quantificar expressão Reprodutibilidade Analisar modificações pós-traducionais Tempo de execução Avaliar várias proteínas Não é automatizada Proteínas de membrana Proteínas: pI e MM extremas

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA Digestão: tripsina Espectrômetro de massas m/z Programas: identificar a proteína Espectros de massas

ESPECTROMETRIA DE MASSAS Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético. Fonte de Ionização Amostra Analisador Detector Dados Recipiente com baixa pressão

ESPECTROMETRIA DE MASSA Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF) Tempo de vôo Detector amostra Laser Karas & Hillkamp (1998)

ESPECTROMETRIA DE MASSA m/z Espectros de massas peptídeos Espectrômetro de massa Impressão Digital de peptídeos Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Proteína Biomarcador

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Método de separação física baseado na migração diferencial de compostos, devido a suas distintas interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob pressão) e a fase estacionária (pequenas partículas). peptídeos

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Fase líquida: Solvente: alto grau de pureza Fase estacionária: Exclusão molecular Poros com tamanhos controlados Troca iônica Altamente carregada (íons + ou -) MATT et al. 2008

SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Detector Bomba de alta pressão amostra Reservatório fase móvel coletor Registro e análise dos dados

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Métodos de detecção: Absorbância (UV) Fluorescência Espectrometria de massa CLEM proteínas

CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM (ES/ES) Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF) Camara de colisão m/z MATT et al., 2008

ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM) m/z Espectrômetro de massa (EM/EM) Espectros de massas Sequenciamento de novo da proteína Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Proteína Biomarcador

Manutenção do equipamento Tabela 1. Vantagens e limitações da cromatografia líquida de alta performance. Vantagens Limitações Tempo de execução Custo do equipamento Automatização Manutenção do equipamento Versatilidade

ABORDAGEM PROTEÔMICA E IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Do geral para o particular Analisar proteomas de condições distintas e identificar as diferenças Do particular para o geral Analisar uma proteína e inferir suas funções no contexto do todo Separação de proteínas nas amostras Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC) fragmentação Espectrometria de Massas: Determinação de massas para identificação Impressão digital de peptídeos Sequenciamento de novo Bioinformática MANN et al. 2001 PROTEINA

Identificação da bactenecina no muco cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um modelo ovino de trabalho de parto MS/MS Indução de parto Dexametasona (+) Bactenecina Trabalho de parto 0 h 28 h YOUNG et al. (2007)

Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H3 (HNRPH3) Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas de linhagens de galinhas de alta e baixa produção de ovos corte 18 semanas 60 semanas CLAP-MS/MS Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H3 (HNRPH3) poedeira (HNRPH3) (+) KUO et al. (2007)

Proteína Osteopontina como biomarcador de fertilidade em bovinos AIDA et al. (1999) Purificação Sequenciamento identificação Osteopontina Alta fertilidade 55 kDa; pI = 6,2 sêmen FIV Baixa fertilidade (+) oócitos KILLIAN et al. (1993) GONÇALVES et al. (2008)

Desafios na Abordagem Proteômica e Identificação Biomarcadores Otimização dos bancos de dados Detecção de proteínas em baixas concentrações; Automatização das técnicas;

Perspectivas da abordagem proteômica e identificação de Biomarcadores Diagnóstico e prognóstico de doenças e animais humanas e animais; Seleção de animais de produção; Descoberta de novos princípios da fisiologia celular; “Metabolômica”;

Rodrigo V. De Oliveira oliveirarv@rocketmail.com