“Validação de metodologia na área química” Procedimento prático de validação de métodos analíticos físico-químicos Shirley Abrantes 14 a 16 de outubro  de 2003 V Encontro do Instituto Adolfo Lutz-Centro de Convenções Rebouças-São Paulo/SP e. mail: shirley@incqs.fiocruz.br

Conteúdo 1- Planejamento de validação 2- Como proceder para determinar as características de desempenho de métodos 2.1- Aplicabilidade 2.2- Faixa de trabalho 2.3- Linearidade 2.4- Faixa linear de trabalho 2.5- Sensibilidade 2.6- Homocedasticidade/heterocedasticidade 2.7- Limite de detecção 2.8- Limite de determinação/quantificação 2.9- Exatidão/recuperação 2.10- Precisão 2.10.1- Repetitividade 2.10.2- Precisão intermediária 2.10.3- Reprodutibilidade 2.11- Seletividade 2.12- Robustez

Validação Um processo através do qual estudos de laboratório são utilizados para garantir que o método em questão atenda às exigências desejadas

Tipo de método FDA. International Conference on Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology; Availability. Federal Register. V. 60 (40) p. 11260-11262, March, 1995. Procedimento analítico Identificação Teste de Quantitativo Impureza Ensaio-limite Doseamento Exatidão Não Sim Precisão Repetitividade Intermediária Especificidade LD LQ Linearidade Faixa

Parâmetros de desempenho analítico a serem avaliados Aplicabilidade Faixa de trabalho Linearidade Homocedasticidade/heterocedasticidade Faixa linear de trabalho Sensibilidade Limite de detecção Limite de determinação/quantificação Precisão (repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade) Exatidão/Taxa de recuperação Seletividade Robustez

Aplicabilidade Determinar qual ou quais matrizes e analito ou analitos para que o método analítico serviria, Identidade do analito, incluindo especificação onde apropriado (p. ex: arsênio total), Faixa de concentração coberta pela validação (p. ex: 0 – 50 mg/kg), Uma especificação da faixa de matrizes do material teste coberta pela validação (p. ex: frutos do mar), Descrever o equipamento, reagentes, procedimento (incluir variação permissível p. ex: aquecer 100±5ºC por 30±5min), procedimento de calibração e qualidade e, precaução de segurança especial necessária, A aplicação pretendida e sua incerteza crítica (p. ex: análise de alimento para monitoramento). A incerteza padrão u(c) do resultado c deveria ser < 0,1 x c. THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.

Faixa de trabalho A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre um décimo a dobro do limite de restrição (LR) 0,1 . LR ≤ FT ≤ 2 . LR FRAUNHOFER INSTITUT FÜR LEBENSMITTELTECHNOLOGIE UND VERPACKUNG – Guide for testing of analytical method for the determination of monomers in foods simulants and polymers. München. 3p. M&T Project “Development of methods of analysis”. Printed papers.

Linearidade É a habilidade das respostas analíticas serem diretamente proporcionais às concentrações das substâncias em estudo. Será verificada analisando em triplicata soluções padrão com 6 ou mais concentrações diferentes, dispostas em um intervalo estabelecido pela faixa de trabalho. Os valores encontrados para confecção da curva analítica têm que estar livres de valores aberrantes e os mesmos devem apresentar homocedasticidade.

Cálculo do ponto duvidoso na curva analítica Pode-se verificar se algum ponto de concentração desvia da linearidade da curva por meio do cálculo dos resíduos entre os valores medidos e os valores calculados a partir da equação da curva. Calcular um ponto duvidoso de uma curva analítica pelo valor de t. tcalculado= resíduo sr/n Onde: resíduo = |xmedido - xcalculado| sr =desvio padrão dos resíduos sr =  (xmedido – xcalculado)2 n = número de pontos da curva n - 1

Procedimento para determinação da linearidade Como o limite de restrição estabelecido pela Resolução 105 de 19-05-1999 da ANVISA/MS é de 0,25% m/m de estireno na massa plástica, a faixa de trabalho é de 0,025 a 0,50% m/m 0,025 ≤ FT ≤ 0,50% m/m

Procedimento para determinação da linearidade Considerando a massa tomada da amostra de 300mg, a faixa de concentração na alíquota analisada seria de 7,5 a 150mg/L. Por praticidade, fez-se a faixa de 10 a 150mg/L

Preparo da solução mãe Pesou-se 0,1066g de estireno com 99% de pureza. Diluiu-se esta massa em balão volumétrico de 100mL com n-heptano. Considerando a pureza do estireno 99%, o procedimento resultou em solução com concentração de 1,055mg/mL

Preparo da soluções de trabalho Com pipetas volumétricas, tomou-se alíquotas da solução mãe para preparo das soluções de trabalho. Todas as alíquotas foram avolumadas a 100mL com n-heptano

Volumes tomados da solução mãe e concentração das soluções de trabalho Volume Tomado (mL) 0 1 2 5 10 Concentração (mg/L) 0,00 10,55 21,10 52,75 105,5

Preparo da curva analítica Os pontos de concentração das soluções de trabalho foram analisados no cromatógrafo. As áreas dos picos correspondentes ao tempo de retenção do estireno em relação aos pontos de concentração foram medidos e, uma curva analítica foi construída a partir das áreas com seus correspondentes pontos de concentração das soluções de trabalho

Determinação da estabilidade da solução mãe De semana em semana retiramos uma alíquota de 5mL da solução mãe de estireno em heptano e avolumamos com heptano para 100mL em balão volumétrico. Tomamos uma alíquota desta solução e injetamos em cromatógrafo a gás. Observamos se o resultado da concentração obtida é semelhante ao obtido inicialmente na confecção da curva analítica

Homocedasticidade/heterocedasticidade É a independência ou dependência da variância das respostas com as concentrações do analito

Determinação da homocedasticidade Analisou-se em triplicata todos os pontos da curva analítica (10,55 – 105,5 mg/L), calculando em seguida as variâncias das respostas de cada ponto de concentração. Dividiu-se a maior variância (S2) pelo somatório das variâncias (∑ S2). O valor obtido é comparado com o valor tabelado Variância S2 = 1/n-1  [xi – X(médio)]2

Homocedasticidade Se o valor calculado for menor que o tabelado de Cochran, o método é homocedástico. Portanto, a curva analítica pode ser construída pelo método dos mínimos quadrados normais C cal = S2 maior/ ∑ S2

Determinação da faixa de trabalho Faixa de trabalho é a faixa de concentração do analito na amostra que apresenta resposta linear com a concentração A faixa de trabalho(conc. na alíquota de análise 10,55-105,5 mg/L) possibilitou detectar o estireno dentro dos limites de interesse e a resposta do detector do cromatógrafo conservou-se linear, que foi de 0,035 a 0,35 % m/m concentração na amostra

Sensibilidade Descreve quanto a resposta varia com a variação da concentração do analito. Pode ser expressa como a inclinação da curva analítica (coeficiente angular), expresso pala equação S=dx/dc, onde: dx=variação da resposta, dc=variação da concentração É medida ao mesmo tempo que testa a linearidade Depende da natureza do analito e da técnica de detecção BRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L. Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93-106, 1998.

Limite de detecção LD É a mais baixa concentração da substância em exame que pode ser detectada com um certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental

Determinação do limite de detecção O limite de detecção foi determinado analisando 6 vezes a menor concentração da curva analítica, e o desvio padrão foi multiplicado por 3, este limite é referente a alíquota de análise. Tem que se considerar o procedimento do método para se determinar o limite de detecção do método. Desvio padrão: é igual a raiz quadrada positiva da variância e tem a mesma dimensao da média aritmética S = 1/(n-1)[xi – X(médio)]2 THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.

Limite de determinação/quantificação LQ É a mais baixa concentração da substância em exame que pode ser quantificada com certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental

Limite de quantificação LQ Geralmente é o mais baixo ponto da curva analítica não deve ser determinado por extrapolação UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom Accreditation Service. www.ukas.com

Precisão Repetitividade Precisão intermediária Reprodutibilidade

Repetitividade É o grau de concordância entre resultados de análises individuais quando o procedimento é aplicado repetidamente à múltiplas análises de uma mesma amostra homogênea, em idênticas condições de teste.

Determinação da repetividade Um mínimo de 9 determinações cobrindo a faixa específica para o procedimento (p. ex: 3 concentrações/3 replicatas cada, menor, intermediária e maior); ou Um mínimo de 6 determinações a 100 % de concentração teste Calcular o desvio padrão, o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação ou a variância. GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.

Precisão intermediária Expressa as variações dentro de um laboratório, como: dias diferentes, analistas diferentes, métodos diferentes, ou equipamentos diferentes, sobre uma mesma amostra ou padrão, definindo exatamente quais as condições a variar (uma ou mais)

Determinação da precisão intermediária Os resultados dos dados obtidos em dias alternados, por um mesmo analista, usando um mesmo equipamento, mesmas concentrações e mesma metodologia, deverão ser o mesmo: pode ser comprovado por teste t, onde a hipótese a ser afirmada é que o resultado obtido em diferentes dias são significativamente iguais. Hipótese a ser testada: Ho: 1= 2 Teste t T=( - xmed)/s.(n)-1 onde: =valor de referência, xmed=média dos valores dos resultados de análise, n=número de resultados de análise e s=desvio padrão O valor crítico (tabelado) varia em função do grau de liberdade () e do nível de confiança, sendo que.  = n – 1 Se: ttab > tcalcHo é aceita ttab< tcalcHo é rejeitada

Reprodutibilidade É o grau de concordância entre os resultados das medições de um mesmo mesurando, efetuadas sob condições variadas de medição(VIM). A reprodutibilidade não é um componente de validação de método executado por um único laboratório, é obtido em relação aos dados de validação obtidos através de comparação interlaboratorial (INMETRO, 2002). INMETRO. Orientações sobre validação de métodos de ensaio químicos. DOQ-CGCRE-008, revisão:00-outubro 2002. VIM – Vocabulário Internacional de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.

Exatidão É a concordância dos valores experimentais com o valor verdadeiro X

Taxa de Recuperação É a relação entre o resultado experimental obtido depois da análise de uma amostra, fortificada com uma quantidade conhecida do analito, e o valor teórico desta quantidade fortificada

Determinação da taxa de recuperação A taxa de recuperação será calculada pela divisão entre o resultado da concentração média experimental e a concentração teórica multiplicada por 100. Taxa recuperação=[conc. Exp./conc. Teor] x 100.

Seletividade É a interferência por outra substância, que não seja o analito de interesse, na medição pelo detector

Determinação da seletividade Analisa-se três vezes a solução de estireno em heptano na concentração de (10,55mg/L) e depois analisa-se três vezes uma amostra que apresente na alíquota de análise uma concentração próxima a concentração de (10,55mg/L) e depois calcula-se o teste de igualdade de duas médias de amostras independentes (t)

Determinação da seletividade O cálculo do valor de t quando se comparam médias de duas amostras diferentes é dado pela expressão t = x - x 1 2 Sa 1 / n + 1 / n 1 2

Determinação da seletividade Sa é a estimativa do desvio padrão agregado, calculado a partir das estimativas dos desvios-padrões das duas amostras Sa =

Robustez É a capacidade de um método de não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros

Determinação da robustez Resultados das amostras a 48 e 120 h DEHA % m/m DEHP % m/m 48 120 h 48 120 h 0,286 0,306 9,43 10,12 0,270 0,325 9,13 10,95 0,276 0,329 9,28 10,99

Determinação da robustez pelo teste t Resultados da mesma amostra nos tempos de contato de 48 e 120 horas Plastificantes DEHA DEHP Desvio padrão das diferenças 0,020 0,624 (%m/m) Teste de igualdade de duas médias 3,760 3,910 T tabelado 4,303 4,303