ANÁLISE DA EFICIÊNCIA DE KITS DE TUBO DE ELISA COMERCIAIS PARA A DETECÇÃO DE MICROCISTINA EM ÁGUA BRUTA E TRATADA DE VÁRIAS REGIÕES BRASILEIRAS Soares, R.M.a; Azevedo S.M.F.O.a; Fan, T.S.b and Skoczenski, B.b a- Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC)- Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho- Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ-Brazil. b- Beacon Analytical Systems Inc., Portland ME, USA. Análise direta Todas as amostras foram analisadas diretamente quanto a presença de microcistina utilizando o kit de ELISA de tubos comercial da Beacon. Teste de recuperação 2 mL de cada amostra foram contaminados com 2ng de padrão de MCYST-LR fornecido pela Beacon (concentração final = 1ng/mL) e analisados utilizando-se o mesmo kit. ELISA O kit de ELISA de tubo para microcistina da Beacon utiliza anticorpos policlonais que se ligam às microcistinas e ao conjugado microcistina-enzima. Microcistina na amostra compete com o conjugado microcistina-enzima por um número limitado de sítios de ligação de anticorpos nos tubos. Todo o procedimento é feito em poucas etapas e o kit pode ser fornecido com um mini espectrofotômetro de fácil manuseio ( Hach ). Procedimento: 1. Adição ao tubo de 500uL de cada: -- Conjugado microcistina-HRP -- Controle negativo, calibradores, amostras -- Solução de anticorpo anti-microcistina 2. Incubação da mistura por 20 minutos. 3. Lavagem da moléculas não ligadas. 4. Adição de 500uL de solução de substrato. 5. Adição de 500uL de solução Stop. 6. Leitura em 450nm em espectrofotômetro. Introdução Florações de cianobactérias tem ocorrido com frequência em corpos d’água utilizados para abastecimento. Após o incidente de Caruaru em 1996, a preocupação quanto ao seu risco para a saúde humana tem aumentado em todo o mundo. No Brasil, isso levou a revisão da legislação sobre a qualidade da água e a adoção de cianobactérias e microcistina como parâmetros de monitoramento obrigatórios. Conseqüentemente, as companhias de água brasileiras são agora cobradas a adaptar suas rotinas analíticas a fim de atender essas exigências. O “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (ELISA), tido como a mais prática metodologia para detecção de microcistina na água, tem se tornado uma importante ferramenta de análise para as companhias de água. Entretanto, em países em desenvolvimento, o uso de kits comerciais de ELISA tem enfretado três principais problemas: preço, pouca disponibilidade de técnicos bem treinados e, algumas vezes, condições laboratoriais inadequadas. Com o objetivo de superar estes problemas e contribuir para um melhor e mais fácil monitoramento de microcitina na água bruta e tratada, assim como em água utilizada em clínicas de diálise, a Beacon e o LETC-UFRJ cooperaram em um projeto para avaliar a eficiência de kits de ELISA de tubos desenvolvidos pela Beacon na detecção e quantificação de microcistina em amostras de água de dez estados brasileiros e três clínicas de diálise. Resultados Região Amostra Mcyst Conc.(mg/L) Teste de recuperação HPLC (mg/L)/ %ELISA Norte 1 bruta ALD 106% 1 tratada ALD 107% 2 bruta ALD 85% 2 tratada ALD 83% 3.1 bruta ALD 117% 3.1 tratada ALD 104% Nordeste 3.2 bruta ALD 103% 3.2 tratada ALD 111% 4 bruta ALD 111% 4 tratada ALD 105% Centro 5 bruta ALD 143% - Oeste 5 tratada ALD 126% 6.1 bruta 4.60 - 3.24 - 70.5% 6.2 bruta ALD 98% 6 tratada ALD 88% Sudeste 7 bruta 12.02 - 4.06 - 39.8% 7 tratada ALD 81% 8.1 bruta ALD 108% 8.2 bruta ALD 117% 8.2 tratada ALD 101% 9 bruta 5.10 - 3.88 - 76.2% Sul 9 tratada ALD 98% 10 bruta 1.71 104% ALD 10 tratada ALD 115% 1 pré-OR ALD 106% 1 pós-OR ALD 118% Clínicas 2 pré-OR ALD 113% de diálise 2 pós-OR ALD 122% 3 pré-OR ALD 116% 3 pós-OR ALD 116% Material e Métodos Coleta de água Amostras de água bruta e tratada foram obtidas de 10 estados brasileiros nas 5 diferentes (Norte, Nordeste, Centro-Oeste, Sudeste e Sul). As amostras apresentaram as seguintes características gerais: Análises de PDA-HPLC das amostras positivas por ELISA Clean-up Cartucho de C18 ( 500mg Bond Elut – Varian) Etapas de lavagem – H2O, MeOH 20% Eluição –MeOH 100% (seco e ressuspenso em in 1mL de MeOH 50% ) Chromatographic conditions (Shimadzu SPD-M10A) Coluna – analítica de fase reversa - Lichrospher 100 RP-18 (5m - Merck) Condições isocráticas – fase móvel de acetonitrila e acetato de amônio 20mM pH=5.0 (28:72v/v) Volume de injeção – 100uL Detecção - 238nm e o espectro de absorção de cada pico analisado na amplitude 190-300nm. Quantificação – curva padrão de MCYST-LR (padrão Sigma-Aldrich). Concentração expressa como equivalentes de MCYST-LR . Região Temperatura(0C) pH Condutividade (uS) Estado Trófico Cianobactérias Norte 27.7 6.1 38 Nordeste 29-30 7.8-8.5 338-465 Centro- Oeste ausente Sudeste 24-27.8 6.5-8.17 34-1480 Sul 23.5-25 7.1-7.5 47.8 umhos/cm mesotrófico eutrófico Planktothrix, Cylindrospermopsis Microcystis Anabaena Planktothrix,Oscillatoria, Pseudoanabaena, Cylindrospermopsis Microcystis, Anabaena, Planktolyngbya, Radiocystis Limnothrix, Cylindrospermopsis Microcystis, Anabaena Raphidiopsis, Aphanocapsa Tabela 1 – Resultados de ELISA da análise direta e do teste de recuperação e resultados de HPLC das amostras positivas. ALD = abaixo do limite de detecção, OR= osmose reversa. Conclusões Os kits de tubo de ELISA da Beacon foram eficientes na detecção de microcistina em água bruta e tratada ao nível de ppb. Diferentes qualidades de água não interferiram na detecção de MCYST-LR pelo kit de tubo. 3. O teste de recuperação ao nível de 1ppb de MCYST–LR mostrou uma recuperação média de 109% na água bruta e de 106% na água tratada. 4. Os kits de tubo de ELISA da Beacon provaram ser um método eficiente, econômico e prático para o monitoramento de microcistina na água. MCYST-LR Preparo da amostras Todas as amostras foram submetidas a ciclos de gelo-degelo para romper quaisquer células de fitoplâncton presentes e liberar as toxinas, para que assim se fizesse a análise de microcistina total ( dissolvida e particulada) na água. As amostras foram em seguida filtradas em filtros de borosilicato para remover material particulado. Figura 1 – Cromatograma da amostra de água bruta 7. Pico 3 (tempo de retenção = 4.2 min) indica Microcystin-LR. Agradecimentos Gostaríamos de agradecer Erik Wiklund (Word Biotch Connnection) e Ricardo Nery (Nery Representações) pelo apoio geral. Pela coleta e envio das amostras gostaríamos de agradecer José Vieira (UFPA), Andréia Ferreira (UFC), Ivaneide Soares (UFRN), Cristina Brandão (UnB), e as equipes do Instituto Ambiental do Paraná, COMPESA, COPASA, SABESP, CORSAN, CDR – Centro de Nefrologia.