1 CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS EM ALIMENTOS ÁSPÉCTOS RELATIVOS A METODOLOGIAS 26/10/09

2 Tese de Doutorado Dr. Mario Killner Profa. Dra. Bernadette D.G. M. Franco UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Ciência dos Alimentos - Área de Bromatologia Paralelos entre Métodos Fenotípicos, Imunológicos e Genotípicos para Detecção Rápida de Salmonella spp em Matizes Alimentares sem Contaminação Experimental: Avaliação em Condições Reais e Simultâneas de Uso

3 INTRODUÇÃO Respostas rápidas: monitoração de processos de produção e/ou produtos terminados; Por quê métodos rápidos? Redução de custos: performance (estocagem, otimização de processos, segurança alimentar); Facilidade de treinamento dos analistas.

4 INTRODUÇÃO Avaliações nem sempre foram realizadas com matrizes alimentares sem contaminação experimental; Limitações dos trabalhos encontrados Foram desenvolvidas em condições laboratoriais artificiais, não reproduzindo condições de trabalho de rotina. Ausência de informações quanto a eventuais diferenças de desempenho dos kits, face à contaminação experimental ou artificial.

5 OBJETIVO 1.Avaliar criticamente diferentes métodos de detecção de Salmonella spp em alimentos, nas seguintes condições de uso: Matrizes naturais, sem contaminação experimental; Emprego simultâneo dos sistemas em avaliação para análise de uma mesma amostra de alimento, tendo a ISO 6579:2002, como método de referência; 2.Contribuir com informações adicionais, que possam subsidiar os laboratórios na seleção de novos métodos para detecção de Salmonella spp em alimentos.

6 MATERIAIS E MÉTODOS

7 Amostras sem contaminação experimental MATERIAIS E MÉTODOS

8 Pré –enriquecimento Não seletivo para todos Seletivo quando esta- belecido na metodologia Amostra ISO 6579:2002 BAX Salmonella TECRA UNIQUE Salmonella VIP Salmonella Transia Plate Salmonella Gold VIDAS Salmonella (SLM) Singlepath Salmonella 1-2 Test MATERIAIS E MÉTODOS

9 Determinação do limite de detecção carne, leite e gelatina Matrizes utilizadas:

10 MATERIAIS E MÉTODOS Determinação do limite de detecção Sorovares utilizados: (pool) Salmonella Infantis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Heidelberg e Salmonella Enteritidis

11 MATERIAIS E MÉTODOS Determinação do limite de detecção Níveis de inóculo por matriz: 1,0 (UFC/25 g) 4,0 (UFC/25 g) 9,3 (UFC/25 g) 12,7 (UFC/25 g) e 33,3 (UFC/25 g) Determinações realizadas em triplicata.

12 MATERIAIS E MÉTODOS Determinação do limite de detecção Análises envolvidas: 3 x 5 x 8 x 3 = 360 análises Matrizes utilizadas 3 Níveis de inóculo por matriz 5 Métodos avaliados 8 Determinações realizadas 3 (triplicata)

13 RESULTADOS Positividade encontrada para Salmonella spp nos diferentes grupos de amostras analisadas pela metodologia ISO 6579:2002 Grupos de amostras Número de amostras analisadas Positividade para Salmonella spp Distribuição das amostras positivas para Salmonella spp por grupo de matriz analisada Número de amostras positivas Percentual de amostras positivas no grupo Frango, ovos e produtos avícolas ,5%30,0% Farelo de soja ,5%18,0% Carnes e produtos cárneos ,8%42,0% Outros produtos ,0%10,0% Total ,5%100,0%

14 RESULTADOS Porcentagem de concordância dos resultados presuntivos positivos para Salmonella spp nos métodos rápidos avaliados em relação aos resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002, nos diferentes grupos de amostras analisadas Métodos GruposBAXUniqueVIPTransiaVIDAS Singlepath 1-2 Test Frango, ovos e produtos avícolas 93,3%64,3% 90,9%92,9%57,2%42,3% Farelo de soja 100% 77,8%88,9% 100% 44,5%55,6% Carnes e produtos cárneos 90,5%50,0%85,0%90,0% 85,0%90,0% Outros produtos80,0% 100% 75,0%80,0%

15 RESULTADOS Métodos GruposBAXUniqueVIPTransiaVIDAS Singlepath 1-2 Test Frango, ovos e produtos avícolas 6,6%35,7% 9,1%7,2%42,9%53,8% Farelo de soja 0% 22,2%11,1% 0% 55,6%44,4% Carnes e produtos cárneos 9,5%50,0%15,0%5,0%10,0%15,8%5,3% Outros produtos20,0% 0% 25,0% 0% Total8,0%35,4%18,8%6,7%6,2%31,9%26,7% Resultados falso-negativos para Salmonella spp nos métodos rápidos avaliados em relação aos resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002, nos diferentes grupos de amostras analisadas (a) (a) Valores calculados considerando as amostras analisadas pelo método avaliado em relação ao método ISO 6579:2002, descontando-se os resultados duvidosos

16 RESULTADOS Resultados analíticos consolidados dos diferentes métodos avaliados na pesquisa de Salmonella spp em amostras de carne, leite em pó integral e gelatina granulada artificialmente contaminadas com um “pool” de cepas de Salmonella Enterica em 5 níveis de inóculo. ISO 6579: 2002 BAXVIDAS Tran- sia Vip Single- path 1-2 Test Unique Porcentagem de concordância (a) 100%97,7%100% 93,2%81,8%95,5%75,0% Resultados presuntivos positivos (b) 44 (d) Resultados negativos (c) Resultados duvidosos Não aplicável Total de amostras analisadas44 (a) Porcentagem de concordância com a positividade encontrada pela metodologia ISO 6579:2002, nos 5 níveis de inóculo, em relação às amostras analisadas pelo método avaliado. (b) Resultados presuntivos positivos coincidentes com os resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002 (c) Resultados negativos encontrados nas metodologias analisadas, nos 5 níveis de inoculo, nas diferentes amostras (d) Para o método ISO 6579:2002, estes resultados são positivos confirmados

17 RESULTADOS

18 CONCLUSÕES Nas condições em que este presente trabalho foi desenvolvido pode-se concluir que: o desempenho dos métodos rápidos avaliados na detecção de Salmonella spp em alimentos sem contaminação experimental pode diferir substancialmente daquele apresentado em alimentos artificialmente contaminados; os métodos rápidos avaliados devem ser utilizados unicamente para fins de triagem, sendo que uns têm maior capacidade do que outros para indicar em curto espaço de tempo quais amostras de alimento poderiam estar contaminadas com Salmonella spp;

19 CONCLUSÕES os métodos rápidos avaliados podem dar resultados falso-positivos, em porcentagens que variam de acordo com a matriz alimentar analisada, ou seja, podem indicar falsamente a presença de Salmonella spp, implicando na necessidade de confirmação do resultado antes da liberação do resultado final. O laboratório deverá estar capacitado para o atendimento destas situações; os métodos rápidos avaliados podem dar resultados falso-negativos, portanto apresentam o perigo de não detectar Salmonella spp, eventualmente presente, nas amostras analisadas, levando à liberação de resultados equivocados;

20 CONCLUSÕES o desempenho dos métodos rápidos avaliados pode variar com a matriz alimentar analisada. Assim, a seleção do método rápido a ser utilizado para a pesquisa de Salmonella spp, em um dado tipo de alimento depende de uma avaliação prévia de seu desempenho nesse tipo de alimento; a adoção de um método rápido para detectar Salmonella spp em determinada matriz alimentar tem um risco intrínseco. A seleção de um dado método rápido só deve ser feita após a determinação do grau de risco que se queira assumir.

21 Obrigado! Laercio Goularte SFDK Laboratório de Análise de Produtos Ltda.