Cultura Celular a Curto Prazo BIO1940 - Citogenética Básica Dr. Cláudio C. Silva PUC-Goiás / BIO

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Amostra Heparinizada Fitohemaglutinina Meio RPMI Glutamina Soro Fetal Bovino Antibióticos Cultura Celular

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Preparação das Lâminas Colchicina Hipotônica Fixador Limpeza da lâminas Gotejamento da amostra Coloração com Giemsa 4%

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Análise Microscópica

Protocolo de Cultura Celular Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Protocolo de Cultura Celular Coleta das Amostras Sangue periférico Heparinizado................... 1,0mL Meio RPMI....................................................4,5mL Glutamina.......................................................0,1mL Soro Fetal Bovino..........................................1,0mL Fitohemaglutinina..........................................0,1mL Antibióticos................................................... 0,1mL Incubar na estufa 37oC durante 47h; Acrescentar 10g/mL (100L) colchicina em cada cultura; Incubar por mais 1h (47h+1h=48h de cultura) Ao completar 48h de cultura fazer a colheita;

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Transferir a amostra para um cubo cônico de centrífuga; Centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de solução hipotônica previamente aquecida de KCl a 0,075M; Colocar na estufa a 37oC por 15 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de fixador de Carnoy´s gelado; Aguardar 10 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Repetir os dois últimos passos por mais duas vezes; Gotejar em uma lâmina limpa e desengordurada ± 3 gotas da amostra sob banho maria a 60oC e aguardar 1 minuto;

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Coloração e Análise das lâminas Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Coloração e Análise das lâminas Mergulhar as lâminas em Giemsa à 4% durante 10 minutos; Enxaguar em água corrente; Secar e proceder a análise microscópica da amostra;

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Observar em pequeno aumento para localizar as metáfases e depois em 1000X para a análise microscópica dos cromossomos; Análise Microscópica Microscópio Lâmina Coordenadas Número de cromossomos Observações Recomendações da SBG / 2004 Contagem: 15-20 células Análise: 4-5 células Cariótipo: 2 células