Mutações INSTABILIDADE DO GENOMA HUMANO REPARO DO DNA Genética Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

ESTABILIDADE GENÉTICA SOBREVIVÊNCIA E REPRODUÇÃO REPLICAÇÃO PRECISA DO DNA REPARO DO DNA Falhas Aberrações cromossômicas: mudança no genoma Mutações no DNA: doenças genéticas (câncer)

MUTAÇÃO: qualquer mudança na sequência de nucleotídeos ou arranjo do DNA Células germinativas: Mutação herdável Células somáticas: Mutação somática

Mutações genômicas: numéricas (aneuploidias) Mutações cromossômicas: estruturais Mutações gênicas: mutação de ponto

MUTAÇÕES – LINHAGEM GERMINATIVA OVOCITOGÊNESE: ovócitos formados até 5o mês: número de divisões celulares do zigoto até oócito fertilizado constante: 24-31 divisões → erro de não-disjunção com aumento da idade (aneuploidias) ESPERMATOGÊNESE: 30-31 divisões celulares até puberdade + 5 div. p/espermatogênese (23 ciclos/ano): centenas de divisões celulares dependendo da idade: 30+5[23x(25-13)]= 310 divisões divisões celulares contínuas → risco maior de erros de replicação do DNA → 1/10 espermatozóide → mutação deletéria nova Exemplos: Neurofibromatose Acondroplasia Hemofilia B (avô materno: fonte da mutação nova)

BASE MOLECULAR DAS MUTAÇÕES GÊNICAS Mutações espontâneas Mutações induzidas naturais Agente mutagênico

MUTAÇÃO ESPONTÂNEA ausência de um tratamento com mutágeno: fonte de variação genética Frequência baixa: uma célula em 105 a 108 Mecanismos: erros na replicação do DNA lesões espontâneas: depurinação, desaminação e danos oxidativos (radicais superóxido-O2; peróxido de hidrogênio- H2O2; radicais hidroxila-OH) elementos genéticos de transposição

LESÕES ESPONTÂNEAS: ERROS DE REPLICAÇÃO DO DNA PERDA DE BASES: Depurinação: 5.000 bases púricas (A e G)/dia/célula Desaminação: 100 bases C >U/dia/célula REPLICAÇÃO: DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação TAXA DE MUTAÇÃO (erros de replicação): muito baixa 10-10 por pb/divisão GENOMA DIPLÓIDE HUMANO: ~ 6x109 pb do DNA → menos 1 mutação de pb/divisão

PREVENÇÃO DE ERROS Alguns sistemas enzimáticos neutralizam compostos potencialmente danosos, antes que reajam com o DNA Exemplos: desintoxicação de radicais superóxido produzidos durante os danos oxidativos a-  Enzima superóxido dismutase  catalisa a conversão dos radicais superóxido  peróxido de hidrogênio b-  Enzima catalase  converte peróxido de hidrogênio em água

MUTAÇÕES INDUZIDAS Agentes químicos: Análogos de bases: 5-BrdU Alcilantes: EMS Intercalantes: acridina orange Agentes físicos: Radiação UV Radiação ionizante: raios X, gama Agentes biológicos: Vírus mutação insercional

RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA Absorção da luz UV Estado excitado de uma base púrica ou pirimídica Ligação covalente entre duas pirimidinas adjacentes Anel ciclobutano: dímeros de timina (TT) mais estável dímeros menos estáveis: CT, CC, TU e UU

TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS 1. Substituição de Bases: Mutação de Ponto Mutação de sentido trocado (missense) Mutação sem sentido (nonsense) Mutação de processamento de RNA:destroem sítios consenso de corte; cap, poliadenilação, criam sítios crípticos: códons finalizadores e mudança de matriz de leitura (frameshift) Mutações reguladoras: afetam a ligação de fator de transcrição e controle transcricional

TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS 2. Deleções/Inserções: Adição/deleção: pouco no. bases Deleções maiores: Distrofina Inserção L1 ou Alu: hemofilia A (L1); neurofibromatose (Alu) Deleção/Duplicação (recombinação) Crossing-over desigual Expansão trinucleotídeos repetidos Repetição CAG: D. Huntington Repetição CGG: S. do X frágil

POLIMORFISMO X MUTAÇÃO POLIMORFISMO: variações no DNA ocorrência de dois ou mais alelos relativamente comuns para um único lócus. Variação do DNA na qual cada sequência possível está presente em pelo menos 1% da população. Ocorre comumente e está associado a um fenótipo normal.

Polimorfismos de proteínas: Polimorfismo em sequência codificadora (5% DNA): variante protéica → fenótipos distintos Polimorfismos de proteínas: Grupos sanguíneos ABO e RH Sistema de alfa1-antitripsina (1-AT): doença pulmonar, vários alelos (frequência de 10-75%) Proteínas de destoxificação de xenobióticos: CYP, GST, NAT Proteínas de reparo do DNA: XPD, XRCC1, XRCC2, XRCC3

Polimorfismo em sequência não-codificadora (95% DNA): intergênica ou dentro de íntrons → sem consequência para o funcionamento do gene sem alterar proteínas ESTIMATIVA DE BASES POLIMÓRFICAS: 1:1000 pb

TIPOS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS Minissatélite VNTR Microssatélite STR

APLICAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENÉTICA MÉDICA: Utilização como marcador genético: análise de ligação Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas Detecção de portador heterozigoto Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete Teste de paternidade e aplicações forenses Tipagem tissular para transplante de órgão

RFLP: Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição Alelos 1 e 2: diferentes polimorfismos alteram sítios de restrição Alelo 1: sítio R (cortado pela enzima restrição) Alelo 2: nucleotídeo X  perda R (sem corte) Amplificação (PCR): primers que flanqueiam o sítio de restrição Digestão do produto de PCR com enzima R Eletroforese: gel de agarose RFLP: Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição

POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA SIMPLES (SSLP): - arranjos de sequências repetidas com variação no comprimento devido diferentes números de unidades repetidas (multi-alélicos). MINISSATÉLITES (VNTR): Número Variável de Repetições em Tandem -unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb), MICROSSATÉLITES (STR): Repetições em Tandem Curtas unidades repetidas de 2-4 pb

MINISSATÉLITES (VNTR): unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb), resultam de inserção em tandem. Encontrados preferencialmente nas regiões teloméricas (geralmente não transcritas) → sítio p/ recombinação homóloga. Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA (DNA fingerprinting) http://www.fathom.com/course/21701758/session1.html

Formação de unidades repetitivas http://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm

Vítima de abuso sexual: suspeitos 1 e 2 comparados com DNA do esperma encontrado na vítima Família com filhos biológicos e adotivos: Teste de Paternidade Filha D2: o pai é de casamento anterior Filho S2: adotado http://www.scq.ubc.ca/?p=250

Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA MICROSSATÉLITES (STR): unidades repetidas de 2-4 pb: CACA...CA; CAACAA...CAA; AAATAAAT...AAAT. Existem 6,5x105 microssatélites no genoma humano. Lócus de microssatélite é multi-alélico: cada pessoa deve ser heterozigota em mais de 70% Espalhados por todo o genoma Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA http://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm

Diagnóstico de Doença Genética Doença Ligada ao X (recombinação=0)

POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO – SNP: Mudanças de um único nucleotídeo distribuídas por todo o genoma. Aproximadamente 1:1350 pb no genoma Cerca de 1.42 milhões de SNPs no genoma Polimorfismos com dois alelos Aplicações: marcadores de mapeamento genético; antropologia molecular (evolução) e comparação entre diferentes populações (epidemiologia molecular) Detecção: Chips de DNA (hibridização de nucleotídeos)

REPARO DO DNA Reparar danos no DNA surgidos espontaneamente ou induzidos por mutágenos Reparo de pareamento errôneo Reparo direto Reparo de excisão de bases Reparo de excisão de nucleotídeos Reparo de quebras de fita dupla no DNA

LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR Reparo do DNA Bloqueio do ciclo celular (Checkpoint) Danos DNA Apoptose Identifica lesão no DNA Proteína ATM Sinal p/ p53 → Ativar Genes Reparo DNA

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO MISMATCH REPAIR - MMR reparo pós-replicação: bases incorporadas erroneamente no DNA durante a replicação (DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb) REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação eliminação de bases mal pareadas e alças de deleção/inserção Deslizamentos da DNA polimerase: regiões de microssatélite atua na cadeia recém-sintetizada genes MSH, MLH e PMS Câncer de cólon não-poliposo familial: instabilidade de microssatélites 70 a 85% de risco mutações em MLH1 e MLH2 são mais comuns

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO G A 5’ 3’ Cadeia filha Cadeia parental Base errada MSH3 Reconhecimento do dano e corte na cadeia filha G A MSH2 MSH6  MLH2 PMS2 Reconhecimento do dano e corte na cadeia filha A G Excisão de fragmento de 100 a 1000pb contendo a base incorreta Síntese de DNA e ligação da fita reparada A DNA pol / DNA ligase Fita reparada T A

REPARO DIRETO reversão ativa da lesão → sem retirar a base danificada O6-metilguanina → transição G:C para A:T (produzida endogenamente ou mutagênicos químicos) Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) → remove o grupo metil alto custo energético → uma molécula da enzima é inativada para cada lesão corrigida

DNA restaurado e enzima inativa REPARO DIRETO Agente alquilante G C CH3 O6-Metilguanina G C G C CH3 Reconhecimento da base alterada e transferência do grupo metil para resíduo de cisteína da MGMT Reparo Direto MGMT G C MGMT CH3 DNA restaurado e enzima inativa

REPAROS DE EXCISÃO ETAPAS COMUNS etapa 1 = incisão (endonuclease) e excisão (exonuclease) etapa 2 = ressíntese do DNA (DNA polimerases β, δ, ε) etapa 3 = ligação das extremidades (DNA ligases)

REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER reparo de danos causados por agentes endógenos (hidrólises, oxigênio reativo)  que modificam a estrutura das bases reparo de danos induzidos por radiação ionizante e agentes alcilantes realizado pelas DNA glicosilases  quebram ligações base-açúcar  liberando as bases e gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (sítios AP)  reparado por endonucleases específica cada DNA glicosilase reconhece uma base alterada no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise Etapas: remoção da base danificada (DNA glicosilase)  sítio AP  incisão do sítio AP (endonuclease)  excisão e remoção gerando lacuna  síntese DNA (DNA polimerase)  ligação da cadeia (DNA ligase)

REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER Quebra de cadeia simples * Base danificada DNA glicosilase Reconhecimento e formação do sítio AP XRCC1 PARP Reconhecimento da quebra APE1 Reconhecimento e incisão 5’ do sítio AP  PNK  Incisão 5’ PCNA DNA pol  FEN1 XRCC1 DNA pol Excisão da porção açúcar-P e síntese de DNA Síntese DNA e excisão DNA ligase I Long-patch Ligação da cadeia XRCC1 DNA ligase III Ligação da cadeia Short-patch 1 nucleotídeo 2-13 nucleotídeos

REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NER remoção de adutos no DNA  distorção da dupla hélice dímeros de pirimidina, HAP, cisplatina fatores ambientais principal mecanismo de reparo deficiência: doenças genéticas realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG remove 24-32 nucleotídeos

Xeroderma Pigmentoso Mutações em XPA-XPG  1000 a 4000X o risco de câncer de pele  exposição solar ou irradiação UV

Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) TFIIH: complexo da RNA pol II com atividade de helicase XPG: endonuclease que corta a fita em 3’ ERCC1-XPF: endonuclease que corta a fita em 5’ DNA pol, PCNA, RPA e RFC: síntese da fita nova Ligase

REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DSB (quebra fita dupla): lesão espontânea induzida por radicais de O2 livres, replicação do DNA e agentes genotóxicos como a radiação ionizante causa de aberrações cromossômicas Reparo homólogo (RH)  pareamento com o cromossomo homólogo intacto Reparo de ligação das extremidades não- homologa (NHEJ)  religação direta das extremidades quebradas

REPARO HOMÓLOGO Cromátides irmãs Reparo DNA com fidelidade Radiação ionizante Quebra de cadeia dupla DNA ligase DNA pol Degradação 5’-3’ Síntese de DNA e ligação das cadeias Rad50 MRE11 NBS1 Rad52 BRCA2 Rad51 BRCA1 Rad54 Invasão da cadeia

d. Reparo posterior à duplicação Uma das fitas vermelhas apresenta uma quebra DNA polimerase desloca a fita d. Reparo posterior à duplicação por recombinação semelhante à conversão gênica ligação dos fragmentos heteroduplex duplicação posterior do DNA resulta em 3 alelos e 1 alelo Resultado final: um alelo verde foi convertido em um vermelho

Processamento das extremidades DNA reparado com baixa fidelidade LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGAS Agente danificante DNA fita dupla Quebra de cadeia dupla DNA PKc1 Processamento das extremidades KU80 KU70 XRCC4 DNA ligase IV Ligação das extremidades DNA reparado com baixa fidelidade

http://www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf

SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA Xeroderma Pigmentoso Síndrome de Cockaine Tricotiodistrofia Anemia de Fanconi Ataxia telangiectasia Síndrome de Bloom SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA  freqüência  aberrações cromossômicas  incidência  câncer

manifestações cutâneas (1,5 anos) anomalias oculares (4 anos) XERODERMA PIGMENTOSO (XP)  AR  Clínica manifestações cutâneas (1,5 anos) anomalias oculares (4 anos) anomalias neurológicas (6 meses) Xeroderma (pele seca) Incidência:1/250.000 (USA); 1/40.000 (Japão) Células XP: sensíveis a radiação UV indivíduos incapazes reparar dímeros TT: risco ↑ câncer de pele (2000x) XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos (NER)

grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas defeitos enzimáticos incapacidade de excisar danos induzidos pela luz UV e mutagênicos químicos  diagnóstico exposição a luz solar  tratamento proteção da pele da luz solar chapéus óculos que absorvem luz UV bloqueadores solares roupas protetoras acompanhamento periódico por dermatologista

alterações da pigmentação da pele (64%) baixa estatura (62%) ANEMIA DE FANCONI (FA) AR Clínica anemia alterações da pigmentação da pele (64%) baixa estatura (62%) malformações do rádio (50%) anomalias oculares (41%), renais (34%), microcefalia (37%), deficiência mental (25%) 90% anemia aplástica

 incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos 8 grupos de complementação: FANCA a FANCG (heterogeneidade genética) células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA: -mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ... freqüência  de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e multiradiais,

figuras radiais endorreduplicação

retardo de crescimento pré e pós-natal (145 cm H; 130 cm M) SÍNDROME DE BLOOM (SB) AR Clínica  peso ao nascimento retardo de crescimento pré e pós-natal (145 cm H; 130 cm M) telangiectasias e fotossensibilidade (borboleta) cabeça alongada, microcefalia, inteligência normal imunodeficiência: infecções (respiratórias e gastrointestinais)

Incidência: 1/58.000 judeus asquenazim  figuras quadrirradiais mutações no gene BLM 15q26.1 DNA helicase ( RecQ) papel na replicação e reparo do DNA Risco maior de câncer: carcinomas, leucemias e linfomas

-ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR AR Clínica -ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora -telangiectasia olhos e pele (3 e 5 anos) retardo de crescimento (70%) incidência neoplasias (linfoma e leucemia linfóide) e imunodeficiências incidência: 1/40.000 risco  câncer de mama heterozigotos AT

células AT sensíveis a radiação ionizante e agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-aminofluoreno - 4-NQO)  linfócitos AT rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14  4 grupos de complementação: A, C, D e E mutações gene ATM  gene ATM (11q22-23) diversas vias controle transdução de sinal checkpoint ciclo celular resposta celular ao dano no DNA induzido por radiação  gene ATM interage p53 na checagem G1-S e mutações no gene ATM abolem mecanismo de reparo pré-síntese de DNA  defeito mecanismo de reparo do DNA ou defeito na replicação DNA