Indução e caracterização molecular de mutantes PCR Banco sementes Detecção mutação EMS X Sequenciam.
Vantagens do TILLING Produz grande especro de mutações pontuais (alélicas) Eficiente para genes pequenos Pode focar em regiões de interesse Aplicável para qualquer organismo Não transgênico 3
Detecção enzimática da mutação * CEL I * 1 CA Oleykowski, CRB Mullins, AK Godwin & AT Yeung, ‘Mutation detection using a novel plant endonuclease’ Nucleic Acids Res. 26:4597 (1998)
Mapeamento de final duplo IRD 700 IRD 800
TILLING com alta capacidade Banco de sementes EMS * - + Identificar mutantes seleção indivíduos PCR Sequenciar Desnat. e Renatur. Primers gene específicos Pool de DNA PCR * Digestão com Cel I * - * Desnat. - gel, scan * - * +
A typical 8-fold pool TILLING gel
GelBuddy calls the lanes
GelBuddy calibrates the lanes
Mark the bands
Mark the bands
GelBuddy reports fragment sizes Zerr and Henikoff, NAR, 33;2806, 2005
Projeto TILLING Seattle 384 well liquid handling 8 Li-Cors 8x pooling Production capacity = 12,000 samples/day With amplicons of 1500bp = ~ 16 Mb/day
(Project Aligned Related Sequences and Evaluate SNPs) PARSESNP* (Project Aligned Related Sequences and Evaluate SNPs) Taylor & Greene, NAR 31:3808, 2003
Two-dimensional arraying
Mutagenesis flower seed EMS or MNU MNU+NaN3 M1 M2 bank DNA and seed M3 seed bank DNA and seed M1 M2 flower seed
Distribution of 1890 mutations in 192 TILLed fragments Histogram with map on chromosomes number of sequenced mutations per fragment
Types of polymorphisms identified A:T<>G:C GAA simple repeat: 5 <> 6 <> indel 9 nt
EMS mutagenesis results in: • >99% G:C to A:T transitions • 55 repeated mutations observed, ~56 expected C Exp • some local bias G->A A T G -2 -1 +1 +2 Obs EMS mutagenesis, bias 3