LGCM URLGA 3.1 Introdução Definições: Genoma: Conjunto completo de genes de um organismo Transcriptoma: Conjunto completo de genes expressos sob certas condições Proteoma: Conjunto completo de proteínas LGCM URLGA

LGCM URLGA Número de ORF’s (define o potencial do genoma) Análise do transcriptoma (genes expressos em determinadas células e tecidos) Número de genes LGCM URLGA

LGCM URLGA 3.2 Mapeamento Genômico Definições: Mapa genético: define a distância entre mutações em termos de freqüência de recombinação Mapa por restrição: Digestão do DNA com enzimas de restrição e medição da distância entre os sítios de quebra Mapa definitivo: conseguido através do seqüenciamento do DNA LGCM URLGA

URLGA 3.2 Variação genômica Fenotípico: função do gene é afetada Fragmento de restrição: sítio alvo de enzima é afetado Seqüência: análise direta do DNA Polimorfismo URLGA RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): diferença no mapa de restrição entre dois (ou mais) indivíduos

3.4- RFLPs and SNPs can be used for genetic mapping RFLPs e SNPs são úteis para a construção de mapas de ligação e testes de paternidade. Mapeamento genético: marcadores: RFLPs, SNPs genótipo e/ou fenótipo de interesse freqüência de recombinação

3.4- RFLPs and SNPs can be used for genetic mapping O conjunto de determinados sítios de restrição, genes ou outros marcadores chama-se haplótipo. O alto polimorfismo de RFLPs e SNPs garante que cada indivíduo tenha um componente genético único. paternidade

3.4- RFLPs and SNPs can be used for genetic mapping Polimorfismos de restrição ocorrem aleatoriamente em todo o genoma. Existe a possibilidade de 100% de ligação entre o sítio de restrição e o gene de interesse. diagnóstico, mapeamento e isolamento do gene

3.4- RFLPs and SNPs can be used for genetic mapping Polimorfismos de restrição ocorrem aleatoriamente em todo o genoma. Existe a possibilidade de 100% de ligação entre o sítio de restrição e o gene de interesse. diagnóstico, mapeamento e isolamento do gene

3.5- Why are genomes so large? Não há relação clara entre o tamanho do genoma e a complexidade genética. No entanto, entre os diferentes filos há a necessidade de um aumento mínimo do genoma, o que pode ser refletido em um aumento da complexidade anatômica e fisiológica.

3.5- Why are genomes so large? Não é possível concluir a partir do tamanho do genoma o número de genes de um indivíduo. A complexidade não pode ser determinada apenas pelo tamanho do código genético.

3.6- Eukaryotic genomes contain both nonrepetitive and repetitive DNA sequences Seqüências não repetitivas de DNA. Seqüências repetitivas de DNA. moderadamente repetitivas: 10 – 1000 cópias Transposons: podem ocupar mais da metade do genoma de um eucarioto muito repetitivas: milhares de cópias

3.6- Eukaryotic genomes contain both nonrepetitive and repetitive DNA sequences Repetições podem ser um indicativo do potencial codificador do genoma, pois mRNAs originam-se geralmente de seqüências não repetitivas.

O número genes bacterianos varia uma ordem de magnitude

NÚMERO DE GENES EM BACTÉRIAS O tamanho do genoma é proporcional ao número de genes. Parasitas intracelulares obrigatórios: genoma de até 1,5 Mb Redução do nº de genes (metabolismo e regulação da expressão) Mycoplasma genitalium - ~ 470 genes

E. coli – 4,6 Mb (4249 genes) até 5,5 Mb (5361 genes). Archaea: genoma 1,5 – 3 Mb (1.500 – 2.700 genes) Bactérias de vida livre: 1,5 < 8 Mb Aquifex aeolicus – 1,5 Mb – 1512 genes S. meliloti - ~ 7 Mb - ~ 6000 genes Existe variação entre linhagens: E. coli – 4,6 Mb (4249 genes) até 5,5 Mb (5361 genes).

FUNÇÃO GÊNICA ~ 60% dos genes podem ser identificados por homologia com genes conhecidos de outras espécies Genes relacionados com metabolismo, estrutura celular, transporte e regulação da expressão gênica ~ 25% dos genes não se conhece função

O número total de genes é conhecido para algumas espécies Em eucariotos parece não existir uma relação entre o tamanho do genoma e o nº de genes dos organismos.

D. melanogaster possui um genoma maior que o de C D. melanogaster possui um genoma maior que o de C. elegans entretanto seu nº de genes é menor Resultado de splicing alternativo A. taliana possui um genoma maior do que o do C. elegans Somente 35% dos genes são cópia única

80% dos genes de A. taliana estão presentes em Oryza sativa Oryza sativa X Arabidopsis taliana Genoma 4x maior, porém apenas 50% mais genes 42-45% do genoma constituído por DNA repetitivo 80% dos genes de A. taliana estão presentes em Oryza sativa Destes, 8000 são encontrados apenas em plantas

FUNÇÃO GÊNICA

Tamanho das proteínas: Aumenta de procariotos e archaea para eucariotos PORÉM Isto representa um aumento muito pequeno no tamanho do genoma destes organismos Número de genes expressos?

Quantos tipos diferentes de genes existem? Somente alguns genes são únicos e sua proporção diminui com o aumento do tamanho do genoma O número de diferentes tipos de genes de um organismo em geral é menor que o número total de genes deste organismo Grande parte dos genes são agrupados em famílias, de acordo com a sequência de seus exons.

Duplicação gênica Proteínas relacionadas Mesma proteína

Genes ortólogos – genes que codificam proteínas correspondentes em diferentes organismos. 80% de similaridade Pseudogenes – cópias de genes que se tornaram não-funcionais (devido a mutações, principalmente). Em homens e camundongos estima-se que 10% do total de genes são pseudogenes.

LGCM URLGA 3.10 A conservação da organização do genoma ajuda a identificação de genes. Organização dos genes ativos: O primeiro exon vem imediatamente após o promotor Os exons interiores são flanqueados por regiões de corte O último exon é seguido pela região 3’ A janela de leitura começa com códon de iniciação e finaliza com o códon de terminação. LGCM URLGA

Dificuldades na identificação dos genes ativos: -Algorítmos utilizados para conectar exons não são muito eficientes quando os genomas são muito grandes e há grandes distâncias entre os exons -Distinguir genes ativos de pseudogenes -Essas dificuldades podem ser amenizadas comparando as regiões dos genes com genomas de diferentes espécies.

3.11 O genoma humano tem menor número de genes do que o esperado - Somente 1% do genoma humano consiste em regiões codificadoras - O genoma humano tem entre 30.000- 40.000 genes - Os exons compreendem aproximadamente 5% do gene - Há splicing alternativo em aproximadamente 60% dos genes humanos

3.12 Distribuição dos genes e de outras seqüências no genoma 45% Transposons 1% Exons 24% Introns 5% Grandes regiões duplicadas (10-300kb) 3% Pequenas repetições 22% Outros DNAs intergénicos

Espécies mais complexas evoluem pela adição de novos genes A comparação da seqüência do genoma humano com as seqüências encontradas em outras espécies, revela características do processo evolutivo. Metabolismo básico, replicação, transcrição e tradução Poucos codificam para enzimas – origem ancestral Organelas, componentes do citoesqueleto Diferenciação dos tecidos

Espécies mais complexas evoluem pela adição de novos genes A comparação da seqüência do genoma humano com as seqüências encontradas em outras espécies, revela características do processo evolutivo. Bactérias Vertebrados Adição de grupos gênicos, representando as novas funções necessárias em cada estágio

Cerca de 1300 proteínas são comuns ao proteoma de leveduras, vermes, moscas e humanos. 8% 35% 10% 12% 22%

Muitas proteínas novas comparado com o de outros eucariotos Relativamente, poucos domínios proteícos novos Proteoma humano A maioria é comum ao reino animal Combinações de domínios novas (arquiteturas proteícas diferentes)

Adição de funções requeridas para a interação entre as células

Quantos genes são essenciais? Manutenção de um gene ao longo da evolução Confere uma vantagem seletiva para o organismo Mas quantos, realmente, são essenciais, ou seja, sua ausência é letal para o organismo ?

Análise mutacional Determinar o número de genes essenciais Mycoplasma genitalium - ~2/3 dos genes são essenciais E. coli – pouco menos da metade dos genes parece ser essencial S. cerevisiae – 18,7% dos genes são essenciais para o crescimento em meio rico

Cerca de 50% dos genes envolvidos com a síntese protéica são essenciais

Análise sistemática dos efeitos da perda de função para 86% dos genes de C. elegans

Genes conservados tendem a preencher funções mais básicas, e essenciais; proporção de genes essenciais dentre aqueles que se apresentam em apenas uma cópia por genoma haplóide. Muitos genes letais podem atuar tão precocemente, que nunca vemos seus efeitos. A maioria dos defeitos genéticos conhecidos são devidos a mutações de ponto

Mas como explicar a sobrevivência de genes cuja deleção parece não ter efeito? Redundância Esses genes, na verdade, têm efeitos significantes sobre o fenótipo no mínimo durante a evolução, não sendo evidentes para nós.

Os genes são expressos em diferentes níveis Em qualquer célula, a maioria dos genes são expressos em uma baixo nível. Apenas um pequeno número de genes, cujos produtos são especializados para o tipo celular, são altamente expressos. A proporção de DNA representada em uma população de mRNA pode ser determinada pela quantidade de DNA que pode hibridizar com o RNA. Tecidos somáticos de eucariotos superiores, geralmente, expressam de 10 a 15 mil genes.

Metade da massa representa um único mRNA 35% da reação, complexidade de 26 Mb, que corresponde a ~13000 espécies de mRNA 15% da reação, complexidade de 15 Kb, correspondendo a 7-8 espécies de mRNA

3.16 Quantos genes são expressos? Células eucarióticas expressam aproximadamente de 10.000 a 20.000 genes. Quantos desses genes são expressos em diferentes tecidos? Quantos genes são específicos para cada tecido? Essas questões são geralmente respondidas analisando o transcriptoma.

Existem diferenças substanciais entre genes expressos em larga escala. Mas os mRNAs abundantes representam uma pequena proporção dos genes expressos. Para analisar diferenças entre transcritos de tecidos diferentes, é necessário saber a extensão das interseções no mRNA de pequena escala.

~12.000 genes são expressos tanto no fígado quanto no oviduto. Por exemplo, ~75% dos genes expressos no fígado e no oviduto são iguais. ~12.000 genes são expressos tanto no fígado quanto no oviduto. ~5000 genes adicionais são expressos apenas no fígado. ~3000 genes adicionais são expressos apenas no oviduto.

mRNA expressos em pequena escala sobrepõe-se extensivamente. 90% desse mRNA escasso são idênticos entre rim e fígado de camundongos. Portanto, apenas 10% do mRNA é único para cada tecido. Isso sugere que a maior parte dos genes exercem funções necessárias em todos tipos celulares. São constitutivos (housekeeping genes).

3.17 O número de genes expressos pode ser medido em massa

Genomas de organelas realizam segregação somática em plantas 3.18 Organelas possuem DNA Mitocônndria e cloroplastos possuem genomas que não apresentam herança Mendeliana. Genomas de organelas realizam segregação somática em plantas Comparações de DNA mitocondrial sugere que os seres humanos descendem de uma única fêmea que viveu a 200.000 anos na África.

3.19 Genomas de organelas são DNAs circulares que codificam as proteínas das organelas Formado, geralmente, por moléculas circulares de DNA uma organela apresenta várias cópias de seu genoma Genomas de cloroplastos são relativamente grandes

mitocondrias mostram tamanhos variados de genoma o número de genes codificadores de proteínas é pequeno a maior parte é codificadora de componentes das subunidades dos complexos da respiração I-IV genes codificadores de RNA Genoma mitocondrial apresenta introns, exceto nos mamíferos

3.20 Organização do DNA mitocondrial é variável DNA mitocondrial de células animais é compacto e codifica 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs não há introns e alguns genes se sobrepõem as proteínas estão envolvidas na respiração mtDNA de levedura é 5x maior do que o animal devido à presença de longos introns ocorre maior dispersão de loci

3.21 Mitocondria evoluiu por endossimbiose Células primitivas capturaram bactérias que forneciam as funções de mitocondrias e cloroplastos Homologias em seqüências sugerem que mitocondrias e cloroplastos evoluíram separadamente organelas devem ter transferido genes essenciais para o núcleo da célula transferência ocorreu ao longo de períodos evolucionários e ainda continua mudanças na seqüência são necessárias para o sucesso da expressão

3.22 O Genoma do cloroplasto codifica várias proteínas e RNAs Cloroplastos apresentam DNA com tamanho variado: 120-190 kb codifica todos os rRNAs e tRNAs necessários para a síntese protéica, e aproximadamente 50 proteínas os genes da organela podem ser transcritos e traduzidos pelo aparato da mesma

a origem endossimbiótica do cloroplasto é enfatizada pelas relações entre seus genes e seus correspondentes bacterianos muitos genes dos cloroplastos codificam proteínas que compõem complexos localizados nas membranas dos tilacóides