Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e detecção Técnicas tradicionais

Dificuldades na avaliação (aula anterior): Falta de recursos humanos capacitados Amplitude da diversidade Erosão da diversidade Falta de metodologias Porquê avaliar? Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade. Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

- Técnicas Fenotípicas Etapas da avaliação      Amostragem Processamento Detecção e avaliação: - Técnicas Fenotípicas - Técnicas Imunológicas - Técnicas Moleculares

Amostragem - Representatividade Etapa crítica São usados equipamentos especializados Devem ser considerados os seguintes fatores: - Representatividade - Não alterar os números e as atividades - Evitar a introdução de contaminantes - Estocar em condições adequadas

Como minimizar o problema da representatividade Utilizar amostras compostas em ambientes com distribuição heterogênea Determinar o número mínimo de amostras: Os limites de confiança e extrapolações devem ser determinadas estatisticamente.

Estratégias de amostragem O Ar é um meio restritivo para os microrganismos (*) Acesso - direto Amostragem no Número de microrganismos - Baixo Ar Equipamentos Processamento (acoplado) - Concentração em filtros (*) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos

Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

Diferente de outros ambientes, no ar os microrganismos não se multiplicam Morte dos microrganismos no ar: dN/dt = -k.N ou ln(N/No) = -k.t k - coeficiente de inativação (velocidade específica de morte) Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais Fatores ambientais: Umidade relativa Temperatura Radiação (pigmentação, reparo do DNA) Radicais de O2 Íons

Amostragem do ar 1. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Andersen 2. Simulação respiratória (tamanho partícula 0,8 – 15 μm; velocidade do ar) 3. Colisão - Captura em líquido. Ex: AG-30 4. Centrifugação 5. Filtração 6. Deposição - Coleta passiva

Amostrador de Andersen

Simulação respiratória

Placas após incubação Ágar Dextrose Ágar Sangue

Impacto em líquido: AG-30

Equipamentos para amostragem do ar: Amostragem passiva Apenas microrganismos que caem nas placas Amostragem ativa Recuperação forçada usando um volume determinado

Método usado nas estações espaciais (Dados NASA)

Importância Aeromicrobiologia extramuro: Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS) Fitopatógenos (ferrugem) Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais Despejo de resíduos (sólidos e líquidos) Guerra biológica Aeromicrobiologia intramuro: Edifícios (doenças dos Legionários-Legionella pneumophila, bactéria aquática disseminada pelos aparelhos de ar condicionado e água potável) Viagens de avião Saúde pública - gripes

Depende do nível de matéria orgânica Acesso - Direto ou remoto Amostragem na Números - elevados ou baixos água Equipamentos -Recipientes, filtros, ROV Processamento - diluição ou concentração

Equipamentos ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais (Yellowstone Park) Águas termais são difíceis de amostrar convencionalmente Robô controlado remotamente abre o recipiente no local de amostragem para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades.

Sedimentos Amostragem em Acesso - Remoto Número de microrganismos - elevado Sedimentos Equipamentos - observatórios, sondas Processamento - diluição

Microbiota dos sedimentos Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios. Controle da pressão da amostra. Existem observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas Cowen, 2004

Ventarolas marinhas Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes. Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica. Fisk et al., 1998.

Sedimentos: Elevada diversidade de Bacteria e Archaea 180 reações metabólicas envolvendo N, S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos Existência de diversos micro-nichos

Solo Acesso - direto Amostragem no Números de microrganismos – normalmente elevado Solo Equipamentos - trados, pás Processamento - diluição

Heterogeneidade espacial Problemas: Heterogeneidade espacial solo Distribuição dos microrganismos em agrupamentos Elevada variabilidade entre amostras Tradicionalmente 1-5 g solo Estatística

Solo propriamente dito Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA - 1010 /g Características: 1. Micro colônias (interação ativa dentro das populações) 2. Populações com elevadas velocidades crescimento 3. Modificações ambientais locais 4. Troca genética Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig. Subsolo BIOMASSA - 107/g Distribuição não homogênea

Alguns números sobre a estrutura do solo

Microrganismos no solo Em cada grama de solo tipicamente franco 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos > 1X 1010 células viáveis > 4 X103 espécies < 0,1% são cultivadas in vitro Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA Poucos membros cultivados pertencem a ordens conhecidas Maioria diversidade é desconhecida!

Solo Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar usando riqueza específica e outros índices. Mas as estimativas da diversidade microbiana são difíceis: heterogeneidade, grupos difíceis de cultivar em meio de cultura Estratégias FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos) CHO (carboidratos) Técnicas moleculares usando PCR Sorologia

subsolo Amostragem no Populações - 107 /g Importantes patogênicos para homem subsolo

Importância Cerca de 40 % da água consumida pelo homem provem de fontes subterrâneas Existem gradientes nestas regiões que causam a movimentação dos microrganismos, como quando a água é movimentada em grandes volumes. Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados. Estudo da diversidade da microbiota da subsuperficie é muito complexa.

Microbiota do subsolo Como vivem? Pesquisada nas últimas décadas (dificuldades de amostragem) Inúmeros aeróbios oligotróficos: 103-107/g Análise comunidades: Archaea e Bacteria Metanogênicas (CO2) CH4 Acetogênicas (HCO3-) acetato Bactérias redutoras de sulfatos (BRS) (SO4-2) gás sulfídrico Como vivem? Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos

A 3,4 Km abaixo da superfície Como sobrevivem? A 3,4 Km abaixo da superfície Possibilidades: 1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”. 2. Infiltraram com as águas subterrâneas a partir de águas de superfície. 3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa.

Recentemente descobertos Subsolo Recentemente descobertos 1-10 microrganismos por g de rocha (109/ g de solo rizosférico) Densidade das comunidades é desconhecida: - Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de inviável) - Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo movimento de água e nutrientes) - Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório - Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas. - Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.

Biológicas Amostras Plantas - seiva, filosfera, tecidos Não destrutivas Amostras Plantas - seiva, filosfera, tecidos Biológicas Animais - sangue, dentes, excrementos, secreções

Processamento Concentração - centrifugação e passagem por filtros Problemas: Porosidade dos filtros Composição química Concentração - centrifugação e passagem por filtros Muito raramente as populações microbianas ocorrem em concentrações apropriadas para a contagem. Enriquecimento Problemas: Composição do diluente Tempo de mistura Grau de agitação Diluição - diluições seriadas

Enriquecimento Desenvolvido por Beijerinck Para microrganismos que metabolizam uma substância particular ou que ocorrem em baixas populações na amostra. Enriquecimento Desenvolvido por Beijerinck Consiste na promoção de condições favoráveis específicas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo. Ex 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio. Ex 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de carbono é o naftaleno. Ex 3: coluna de Winogradsky - enriquecimento de quimiolitotróficos. Ex 4: Para isolar Bacillus formadoras de esporos deve-se aquecer a cultura

Detecção dos microrganismos Métodos: Fenotípicos - baseados no cultivo ou avaliação de certas propriedades do microrganismos Imunológicos – baseados nas características sorológicas Moleculares - baseados na constituição genotípica

Fenotípicos Métodos baratos e não requerem treinamento diferenciado Cultivo em meio de cultura Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas. Isolamento  cultura pura  identificação Ex: Geobacter metallireducens CH3COO - + 8Fe3+ + 4H2O  2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+ Utilizar acetato como única fonte de C permite a detecção de microrganismos que usam ferro como fonte de energia

Avaliação da abundância Enumeração Atividade Biomassa Contagem direta Contagem indireta

Contagem direta Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio Fluorescência, anticorpos Vantagens: Não requerem separação do microrganismo. Fornecem estimativas elevadas Desvantagens: Ás vezes distingue entre viáveis e não viáveis. Não permite análises subsequentes

Lâminas para contagem direta

Contagem indireta Contagem em placas NMP Técnica de Diluição e plaqueamento

Plaqueamento Diluição seriada Amplificação sinal fenotípico colônias

Diluições seriadas (resultado)

Enumeração NMP

NMP – número mais provável

Contagem indireta • Bioluminescência: detecta ATP residual • Impedância/condutância: microrganismos alteram a corrente elétrica. Vantagens: - detecção de viáveis - seletividade (uso de meios específicos) Desvantagens: - permite a contagem de somente alguns tipos - Ausência dos não cultiváveis

Avaliação da biomassa Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade. Expresso em gramas e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco Filtração Centrifução Direta Pesagem Indireta Proteína Peptideoglicano Quitina LPS DNA Dentre outros Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.

Avaliação da atividade Fotossíntese – taxa de produção primária Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2 Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase, amilase ...

Viáveis mas não cultiváveis (VNC) Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção. Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.

Requerem vastas livrarias Outras técnicas fenotípicas Requerem vastas livrarias FAME - Fatty acids methyl ester analysis MARA - multiple antibiotic resistance activity CSU - carbon source utilization Detecção de hospedeiros de vírus

Técnica que não envolve cultivo Perfil lipídico - FAME Técnica que não envolve cultivo Existe variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos das membranas, os quais podem ser comparados com dados catalogados. Após comparação, identifica-se os microrganismos desconhecidos. Tem sido usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.

Detecção com corantes vitais e fluorescência Corantes ácidos de núcleo: DAPI e verde SYTOX. Células danificadas exibem fluorescência verde. População mista de Micrococcus luteus e Bacillus cereus com células vivas em verde. Corantes DAPI , fluoresceina e vermelho Texas.