NAPARTICULAS POLIMERICAS PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO AULA 4 QF-933-2008

Introdução Liberação Controlada de Fármacos Liberação de fármacos a uma velocidade e/ou numa localização indicada para a necessidade do corpo ou estado da doença em um período especificado de tempo: Liberação temporal: controle sobre a velocidade da liberação do fármaco Liberação espacial: controle sobre a localização do fármaco Hamid Ghandehari in <hghandeh@rx.umaryland.edu >

Introdução Liberação espacial TUMOR = Molécula do fármaco LIBERAÇÃO EXCLUSIVA DO FÁRMACO A TIPOS ESPECÍFICOS DE CÉLULAS Hamid Ghandehari in <hghandeh@rx.umaryland.edu>.

Tempo/dosagem administrada Introdução Liberação temporal P L s m a l e v Convencional Liberação ordem zero Efeitos adversos Níveis tóxicos Faixa terapéutica Concentração Min. efetiva Sem efeito Tempo/dosagem administrada

Sistema de Liberação Controlada O comportamento do fármaco in vivo pode ser mudado drasticamente ao incorpora-lo num carregador. Os veículos de liberação de fármacos coloidais podem prover: Liberação lenta de compostos as vezes tóxicos Habilidade de guiar uma distribuição sistêmica Habilidade de proteger fármacos de degradação ambiental Habilidade de direcionar a alvos específicos diretamente em tecidos Sistemas coloidais em uso são: Nanopartículas d<1mm Microesferas d>1mm Emulsões 100nm<d<5mm Lipossomas 20nm<d<2mm

Micro/nanoesferas e capsulas NANOPARTICULAS NANOESFERAS Monoliticas Reservatorio NANOCAPSULAS Adapted of Lambert,G. Oligonucleotide and Nanoparticles Page, <http://perso.clubinternet.fr/ajetudes/nano/index. html> dez/ 2003.

METODOS DE PREPARAÇÃO 1- Através de polimerização de monômeros Problemas: obtidas induzindo-se a polimerização. Difícil controle da extensão da reação-massa molar não controlada. Purificação posterior. Interação do polímero com o ativo. 2- Diretamente da macromolécula ou polímero pré-formado.

Polímeros biodegradaveis C O (CH2)5 n O CH2 C n Poli(acido glicolico) ou PGA Poli (-caprolactona) ou PCL O CH C n CH3 Poli(acido lactico) ou PLA Poly(3-hydroxybutyrate-co-valerate) or PHBV

BIOPOLÍMEROS TÍPICOS Polímeros biodegradáveis e bioabsorvíveis; Degradação depende de: MM, estrutura, solubilidade,composição da cadeia,grau de cristalinidade. (PLGA)

EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE Trata-se de um método simples, de fácil transposição de escala e cuja realização em condições assépticas garante a esterilidade final do produto. Em linhas gerais o polímero é dissolvido em solvente volátil em água, como CHCl3 ou CH2Cl2. Se dispersa em água por emulsificação com temnsoativo apropriado. Algumas revisões: Couvreur et al. Eur. J. Pharm. 41, 2 (1995); Alonso. Nanoparticulate drug carrier technology. In Cohgen (Ed). Microparticuate Systems for the delivery of proteins and Vaccines. M. Dekkrt, N.Y. 2996, p. 203; Soppomath et al., J. Control. Rel. 70, 1 (2001).

MÉTODOS MAIS IMPORTANTES DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS Maria I. Rê e M.F.A. Rodrigues-IPT-2004 1-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/EVAPORAÇÃO DE SOLVENTE FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Homogenizaçào Polímero Sonicação Agente ativo EMULSÃO Óleo em água Extração do solvente Evaporação do solvente SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Sanchez et al. Int. J. Pharm. 99, 263 (1993); Zambaux et al. J. Control. Rel. 50, 31 (1998); Verrechia et al., J. Biom. Mater. Res. 27, 1019 (1993) Após a formação da nanoemulsão, o solvente se difunde para a fase externa (extração para a fase aquosa) até saturação da mesma. Com a evaporação das moléculas do solvente que atingem a interfase fase aquosa-ar, reestabelece-se o gradiente de concentração, ou seja, a força motriz para a difusão do solvente orgânico das nanogotas para a fase aquosa. Ao ser eliminado o solvente, o polímero precipita levando a formação das nanoesferas.

Evaporação de solvente modificado (nanoesferas). PREPARAÇÃO Evaporação de solvente modificado (nanoesferas). 2 solventes solúveis entre si (um é não-solvente para o polímero) SEI, 22.000x, 20 kV, topografia Laboratório - Preparação: 10% (surfatante), 0,8% (polímero), 40%etanol/acetona SEI, 2.300 x, 20 kV, topografia

APLICAÇÃO 1- Formação de nanoesferas para substâncias lipofílicas. Este método tem sido modificado para uma emulsão múltipla do tipo água/óleo/água. 2- Limitações: a) Emulsão óleo/água deve ter uma fase dispersa (óleo) bastante fina e homogênea (requer bastante tensoativo e técnicas de agitação elevada). b) Solventes orgânicos (clorados) e tensoativos usados (álcool polivinílico, p.ex.) não são compatíveis com aplicações biológicas. 3- Alternativas: Uso de tensoativos como albumina de soro humano . 4- Propriedades otimizadas: diâmetro médio e distribuição de tamanho; re-suspensão num veículo aquoso sem agregação; teor de fármaco; taxa de liberação, taxa de degradação; esterilidade; apirogenecidade; e teor de solvente residual. 5- Variáveis: Volume da fase aquosa para a fase orgânica; concentração do polímero na fase orgânica; concentração do fármaco na fase orgânica; presença de tensoativo em ambas fases (orgânica e aquosa); solubilidade do fármaco na fase aquosa (nível de saturação); método e velocidade de agitação.

-2-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO ESPONTÂNEA/DIFUSÃO DE SOLVENTE (Niwa et al. J. Pharm. Biopharm. 25, 89 91993). Um solvente miscível em água (acetona, etanol ou metanol) é misturado ao solvente immiscível (CHCl3, ou CH2Cl2). A difusão espontânea do solvente miscívil no meio aquoso cria uma turbulência interfacial entre as duas fases levando a formação de partículas menores. Fase aquosa Fase orgânica Difusão rápida do solvente miscível com água Nanopartículas Quanto maior a proporção do solvente miscívil na mistura menores as partículas formadas.

3-MÉTODO DE NANOPRECIPITAÇÃO FASE AQUOSA Água destilada Tensoativo FASE ORGÂNICA FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Solvente orgânico Óleo Polímero Polímero Agente ativo Agente ativo Agitação SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Envolve o uso de um solvente orgânico que é completamente solúvel na fase aquosa externa consequentemente a extração e a evaporação do solvente não são nescesárias para a precipitação do polímero. p.ex. acetona nanoesferas nanocapsulas Fessi et al. Eur Pat. 0275796 B1 (1987).

Metodo – Encapsulação de agente ativo “Nanoprecipitação” – método de deslocação de solvente 1,2% PLURONIC (1) 3% (PLGA / acetona) + 4 mg de agente ativo (2) (2) colocado em (1)

PLGA nanoesferas – Encapsulamento de violaceina PLGA-PLURONIC-PVA system

4-MÉTODO DE SALTING-0UT FASE ORGÂNICA Solvente orgânico Polímero Agente ativo FASE AQUOSA (sal) Água destilada Agitação Tensoativo (PVA) EMULSÃO Água em óleo SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Esta é baseada na formação de uma emulsão pela incorporação, sob agitação, de uma solução aquosa saturada de alcool polivinílico (PVA) em uma solução de polímero dissolvido em acetona. O PVA tem o papel de estabilizar a dispersão. Aqui a miscibilidade das duas fases é impossibilitada pela saturação da fase aquosa com PVA. A precipitação do polímero ocorre quando uma quantidade adicional de água é adicionada permitindo então a difusão da acetona para a fase aquosa. Este método é adequado quando ativo e polímeros são solúveis em solventes polares como acetona ou etanol. Ibrahim et al. Int. J. Pharm. 87, 239 (1992); Allemann et al., Int. J. Pharm. 87, 247 (1992).

5-MÉTODO DE EMULSIFICAÇÃO/DIFUSÃO DE SOLVENTE FASE AQUOSA (saturada em solvente orgânico) Água destilada Tensoativo FASE ORGÂNICA (saturada em água) Agitação Solvente orgânico Polímero Agente ativo EMULSÃO Óleo em água SUSPENSÃO DE NANOPARTÍCULAS Envolve o uso de um solvente parcialmente miscível em água, que é previamente saturado em água para garantir o equilíbrio termodinâmico inicial de ambas as fases. A precipitação Ocorre quando uma quantidade adicional de água é adicionado ao sistema, permitindo então a difusão do solvente para a fase aquosa. Leroux et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 41, 14 (1995). Quintanar-Guerreo et al. Pharm Res. 15, 1056 (1998). Formada a emulsão do tipo óleo/água e o tensoativo é adsorvido na superfície das gotas da fase orgânica dispersas na fase aquosa A adição de água ao sistema desestabiliza o estado de equilíbrio e promove a difusão do solvente na fase aquosa levando à formação das nanopartículas

VANTAGENS Este método apresenta algumas vantagens sobre o método de nanoprecipitação como a possibilidade de controle do tamanho das nanopartículas. Estas apresentam tamanhos superiores àquelas preparadas por nanoprecipitação, normalmente entre 250-600 nm, dependendo de vários parâmetros como tipo e concentração do tensoativo e do polímero, tempo e velocidade de agitação.

-------------------------------------------------------------- Métodos para a preparação de nanopartículas carregadas com fármacos convencionais -------------------------------------------------------------- Método Polímero Fármaco Tamanho(nm) o/w PLA, PLA-b-PEG Lidocaine 247-817 o/w PLA-PEG-PLA Progesterone 193-335 o/w PLGA Dexamethasone 109-155 o/w PEO-b-PBLA Doxorubicin 37 solv-disp PMLAiPr Halofantrin 150-160 solv-disp PMLAnHe Halofantrin 90-190 solv-disp PLGA Vancomycin 160-170 solv-disp PLGA Procaine Hydr. <210 solv-disp PCL, PLA, Nimodipine 81-132 PCL-co-PLA o/w PEO-b-PCL Enalapril maleate 50 o/w PLA Lidocaine 115-123b a PBLG = poly(g-benzyl L-glutamate); PBLA = poly(b-benzyl L-aspartate); PMLAiPr = poly(b-malic acid isopropil ester); PMLAnHe = poly(b-malic acid neohexil ester). b Dimension of unloaded particles.  

Método Polímero Proteina Tamanho (nm) PREPARAÇÃO DE MICRO E NANOPARTICULAS CARREGADAS COM FÁRMACOS PROTEÍCOS.a Método Polímero Proteina Tamanho (nm) w/o/w PLGA L-asparaginase 196-226 w/o/w PLGA BSA ms w/o/w PLGA BSA 100-200 w/o/w PLGA, PLA BSA ms w/o/w PLGA/PLA blend BSA ms w/o/w PLGA, PCL BSA 20-1000 w/o/w PLA Protein C 230-340 w/o/w PLGA FITC-BSA ms FITC-HRP w/o/w PLGA TRH 250-800 w/o/w PLGA IL-1a+BSA ms o/w PLGA Rism. porcine ms o/w Biod. polym. Peptides - PLGA BSA 300-600 w/o/w PLGA rhBMP ms w/o/w PEG-PLGA BSA - w/o/w PEG-co-PBT BSA ms w/o/w PLGA-b-PEO BSA ms a ms = microsize; CP = coprecipitation; FITC-BSA = fluorescein isothiocyanate-labeled BSA; FITC-HRP = fluorescein isothiocyanate-labeled horseradish peroxidase; IL-1a = recombinant human interleukin-1a; rhBMP = recombinant human bone morphogenetic protein-2

Spontaneous emulsification solvent diffusion (SESD) method

METODOLOGIA No método original SESD, PLGA é dissolvido na mistura de solventes orgânicos consistindo em diclorometano e acetona, que são os solventes orgânicos menos miscíveis em água e um solúvel livremente em água, respectivamente. A solução polimérica obtida acima é lentamente vertida no emulsificante contida na fase aquosa com agitação mecânica. As nanopartículas são formadas via dos seguintes passos: quando a solução polimérica é agregada, gotículas do emulsificante são formadas na fase aquosa; acetona rapidamente difunde para fora de cada gotícula de emulsificante, reduzindo drasticamente seu tamanho a ordem-nano e consequentemente processo de evaporação do solvente, no qual o diclorometano remanescente é removido do sistema, fazendo que as gotículas solidifiquem para finalmente formar as nanopartículas poliméricas.

COMENTÁRIOS Este processo parece bastante razoável, baseado num fenômeno físico-químico interessante. Entretanto, devido a quantidade considerável de diclorometano residual, as partículas tendem a se agregar durante o processo de evaporação do solvente. Logo, quando uma grande quantidade de solução polimérica é usada, a agregação não pode ser prevenida devido a que a probabilidade de colisão entre partículas na fase aquosa poderia aumentar. Alem disto, o processo de recuperação e purificação no método SESD original deverá ser melhorado, já que a ultra-centrifugação ( 156200 x g, 1 h) é inaceitável para processos industriais em grande escala de produção. Também que se evitar o uso de solventes clorados tais como diclorometano devido a sua toxicidade.

No processo modificado-SESD, a mistura de dois solventes orgânicos miscíveis em água, tais como etano:acetona ou metanol:acetona foram empregados em vez de usar a mistura de diclorometano e acetona. Esta alteração previne a agregação de partículas ainda em condições de alta quantidade de solução do polímero, resultando na melhora do rendimento aceitável para propósitos industriais. Esta alteração também permite alguma vantagens adicionais; por exemplo o uso de solventes tóxicos como o diclorometano o processo de purificação e recuperação podem ser simplificados usando ultrafiltração para omitir processos de evaporação do solvente; e nanopartículas uniformes podem ser obtidas sempre por agitação suave.

Figura 2. Efeito de quantidade adicionada de PLGA sobre o rendimento de nanopartículas. (●) método modificado SESD (Etanol:acetonas 4:6); (O)SESD original (DCM:acetona 4:96) Figura 3. Efeito da concentração de PLGA no rendimento de nanopartículas preparadas por etanol:acetona 4:6.

Tabela 1. Diametro e polidispersidade de nanopartículas de PLGA preparadas pelo método modificado-SESD.

Tabela 2. Diâmetro médio e PVA residual nas nanopartículas de PLGA após lavagem e ultrafiltração Figura 3. Efeito da concentração de PVA no rendimento da nanopatícula preparada por etanol:acetona 4:6. PLGA 8%.

Galindo-Rodriguez et al. Pharm. Res. 21, 1428 (2004)

Preparação de nanopartículas Salting-out. Tipicamente, 50 g de solução aquosa de cloreto de magnésio hexahidratado (30,4%, p/p) e PVAL (5- 21%, p/p) são agregados sob agitação mecânica a 30 g de fase orgânica contendo 9,0% (p/p) de E L100-55 (polímero eudragit) em acetona. A agitação foi mantida a 2000 rpm por 15 min. Após emulsificação, 50 g de água pura foram adicionados para induzir a difusão do solvente orgânico na água e a formação das nanopartículas. Emulsificação-Difusão. Para este método, 30 g de uma solução aquosa de PVAL (7–21%, p/p) foi adicionado sob agitação a 21 g de uma solução orgânica de polímero em álcool benzílico (14.3%, p/p). A emulsificação resultante o/w foi agitada continuamente a 2000 rpm por 15 min, e logo, 660 g de água foram introduzidos para permitir a difusão do solvente orgânico para a água. levando a formação das nanopartículas. Nanoprecipitação. A fase orgânica foi preparada por dissolver E L100-55 (360–810 mg) em 25 ml de solvente orgânico (acetona, dimetil sulfoxido, álcool isopropílico, etanol, ou lactato de etila). A solução orgânica foi adicionada na fase aquosa (50 ml) contendo PVAL (0.4%, p/p) e agitada magneticamente.

Tabela 1. Influencia da concentração de PVA na fase aquosa no tamanho da nanoparticula preparada por salting- out e emulsificação- difussão

Para copolímero como PVA na interfase da gotícula, além da redução da tensão interfacial outro citério de estabilização inclui: (1) coberta total da gota, (2) uma forte fixação na interfase, (3) formação de um filme grosso e (4) uma conformação ótima das cadeias do polímero na fase externa. Estes fenômenos tem sido pesquisados para o PVA na interfase solvente orgânico/água. De fato, dois importantes conclusões foram concluídos destes estudos: (i) interpenetração é o mecanismo proposto para explicar a ligação do PVA na interfase da gotícula da emulsão, e(ii) a forte interação do PVA na interfase leva a uma adsorção irreversível do PVA na superfície da nanopartícula. Dados dp PVA residual na nanopartícula, que estão presente, demonstram a presença de PVA não- removivel na nanopartícula. Isto sugere que PVA-E L100-55 interpenetração deveria ocorrer na interfase da gotícula durante a emulsificação (Figura 2). Logo, é assumido que o pacote de cadeias compactada resultam desde uma interpenetração levando a formação de filmes rígidos na interfase da gotícula que resiste cortes e confere estabilidade mecânica para as gotículas da emulsão durante a emulsificação.

Tabela II mostra os valores solvente-água que aumentam na seguinte ordem: etanol < dimetil sulfoxido < álcool isopropilico < etillactato < acetona. Comparando a mesma concentração de polímero (p.ex. 14.4 mg/ml), o tamanho médio da NP preparado usando estes solventes aumenta quase na mesma ordem: etanol < dimetil sulfoxido <álcool isopropil < acetona < etillactato. Etanol, mostrando o valor menor (27.0 MPa1/2), produz a menor NP. Inversamente, acetona, com o valor mais alto (34.4 MPa1/2), deu a NP com o tamanho médio maior. Em geral, esta primeira aproximação sugere que a afininidade solvente-água, correspondendo ao menor valor solvente-água, poderia melhorar a difusão do solvente na fase aquosa externa e logo permitir obter a menor NP.

CONCLUSIONS Os tamanhos por salting-out (123–710 nm) e emulsificação-difusão (108–715 nm) foram maiores que os de nanoprecipitação (147–245 nm). Para os método o tamanho das naniopartículas foram associados as propriedades físico-químicas do solvente e da fase aquosa usadas para suas preparações. Tanto para salting-out como para emulsificação-difusão a nanoemulsão formada foi analisada por MEV e o papel do PVA como emulsificante durante o processo de emulsificação foi amplamente descrito (teoria de emulsificação). Vários mecanismos de estabilização fora, envolvidos: (i) na interfase da gotícula na cadeia polimérica pode não somente reduzir a tensão superficial mas também induzir uma estabilização mecânica como estérica, e (ii) na centro da solução as cadeias de PVA podem aumentar a viscosidade da fase externa induzindo uma estabilização hidrodinâmica. As características do solvente como solubilidade e parâmetros de interação foram considerados para relacionar as propriedades do solvente na formação das nanopartículas (fenômeno de difusão dirigida)(diffusion-stranding phenomenon). Em geral, estas foram encontrada proporcionais a o tamanho das nanopartículas. de outra maneira, usando E L100-55 como polímero, solventes com um  (interação de solvente-água) ≈ 11 (ou Δ (solubilidade solvente-água) ≈ 27 MPa1/2) permitem nanopartículas com um faixa larga para obter tamanhos médios.

Isto demonstra que interação de água com solvente e assim movimento de difusão do solvente, joga um papel importante na explicação da variação do tamanho das nanopartículas pelo método de nanoprecipitação. Finalmente, estes experimentos mostram não somente o papel de cada componente básico (solventes, polímeros, e sais) nas propriedades físico-químicas das fases aquosa e orgânica (viscosidade, tensão superficial e solubilidade), mas também o efeito de tais propriedades na formação das nanopartículas. Isto é importante já que este conhecimento é importante no controle racional de parâmetros ou variáveis que influenciam a formação das nanopartículas permitindo o desenho de nanopartículas com determinados tamanho, características especificas para alvos dirigidos para atingir células ou órgãos.

APLICAÇÕES E ALVOS DIRIGIDOS

MOLECULAR PHARMACEUTICS. 2, 373-383 (2005) A função mais importante da transferina (Tf), uma glicoproteína encontrada abundantemente na sangue, é transportar ferro através da sangue a células através de receptores (TfR). Como os receptores TfR são sobre-expressados em tecidos malignos comparados com os normais, Tf é também pesquisado intensamente como ligante para fármacos com alvos dirigido.

Formulação de NPs: NPs contendo Tx foi preparada pelo método de emulsão-evaporação. Em breve: PLGA e Tx em cloroformio e logo emulsificado em 5% de PVA. A emulsificação foi feita na presença de um sonicador. Após agitação por 12 h e evaporação do solvente as NPs foram lavadas com água para eliminar o PVA e logo liofilizadas.

Figure 3. Internação celular de nanopartículas com Tf-conjugado e não-conjugado em células MCF-7. Uma suspenssão de NPs (100 ug/mL) foi incubado com MCF-7 (5 x 104 células) por 1 h, as células foram lavadas e o nível de NPs na célula foi determinado por HPLC. Para determinar a competitividade na inibição de internalização das NPs-Tf conjugadas, um excesso de Tf livre (50 ug) foi adicionado ao médio antes de incubar as células com NPs de Tf-conjugado.

Atividade anti-proliferativa do Tx ( ▄ ), Tx-NPs(●) e Tx-Tf-NPs (▲)

RETENÇÃO INTRACELULAR POR FLUORESCENCIA CONFOCAL

MICROSCOPIA DE LASER CONFOCAL

PCL/ microesferas de violaceina– Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) Violaceina dispersa em matriz polimérica Barra = 10 m Durán e De Azevedo, 2005

Nanoparticulas + violaceina Microscopia Confocal: gel e nanopartículas Nanoparticulas + violaceina Matriz do gel Gel + nanoparticulas (multitracking) Duran e De Azevedo, 2005

Retenção intracelular do Taxol (Tx) por flurescência confocal fluoroforo: 6-cumarina

Conclusões Foi demonstrado que a conjugação a Tf nas nanopartículas resulta em maior internação do fármaco na célula, sustentando uma retenção intracelular do fármaco e assim melhorar o efeito anti-proliferativo do agente antineoplásico encapsulado nas células cancerosas. Os dados com Tf-conjugado a NPs numa cultura celular resistente ao fármaco sugere que a resistência pode ser sobre passado por retenção intracelular do fármaco. É possível que a liberação do fármaco das NPs poderia influenciar ainda mais o efeito anti-proliferativo da formulação e isto poderia ser otimizado. Seria de interesse determinar como outros ligantes, tais como ácido fólico ou fator de crescimento epidermal, para os quais os receptores são sobre expressados na maioria das células cancerosas, seguindo sua conjugação a NPs influenciariam a retenção celular do fármaco e sua eficácia terapêutica.

AGRADECIMENTOS REDE NANOTUB0S DE CARBONO CNPq/MCT CNPq/MCT