DNA Microarrays

O que é DNA Microarray? Também conhecido como chip de DNA Permite a medida do nível de transcrição de cada gene no genoma (expressão dos genes) Transcrição? Processo de cópia do DNA em RNA mensageiro Dependente do meio Microarray detecta mRNA

O que é DNA Microarray? Cheung et al. 1999

Como fazer um microarray? Começa-se com genes individuais (p. ex. ~6,200 genes do genoma de fungos) Amplifica-se todos eles por PCR “Spot” todos em um meio, como por exemplo lâmina de vidro de microscopia. Cada spot tem 100 µm de diâmetro Spotting feito por um robô. Etapa complexa e crítica do processo.

Como fazer um microarray? Cheung et al. 1999

Exemplo Fungo Cresce em ambientes aeróbicos e anaeróbicos Diferentes genes serão ativados no intuito de se adaptar a cada ambiente. Extrai-se o mRNA Converter o mRNA em cDNA marcado com fluorescência

Exemplo Misturar o cDNA Hibridizar com a sonda Cada sequência hibridiza com o gene correspondente no array Lavar o cDNA não hibridizado Ler com laser Analisar a imagem

Brown & Botstein, 1999

Lendo um array O laser escaneia o array e produz imagens Um laser para cada cor (um para verde, outro para vermelho) Análise da imagem: Supressão de background Localização e detecção dos spots, incluindo a redução da intensidade de background, posição do spot e tamanho deste.

Lendo um array (cont.) Block Column Row Gene Name Red Green Red:Green Ratio 1 tub1 2,345 2,467 0.95 2 tub2 3,589 2,158 1.66 3 sec1 4,109 1,469 2.80 4 sec2 1,500 0.42 5 sec3 1,246 1,258 0.99 6 act1 1,937 2,104 0.92 7 act2 2,561 1,562 1.64 8 fus1 2,962 3,012 0.98 9 idp2 3,585 1,209 2.97 10 idp1 2,796 1,005 2.78 11 idh1 2,170 4,245 0.51 12 idh2 1,896 2,996 0.63 13 erd1 1,023 3,354 0.31 14 erd2 1,698 2,896 0.59

Real DNA Microarray

Y-fold Fold – quantas vezes Expressão como repressão ou indução Y-fold Calculado como o inverso da razão Razão de 0.33 = repressão 3-fold Razão de 10 = indução de 10-fold

Codificação de cor Dados apresentados em escala de cor Esquema: Ou Verde: reprimido (menos mRNA) Vermelho = induzido (mais mRNA) Preto = sem mudança (1:1 ratio) Ou Verde - controle (e.g. aeróbico) Vermelho = experimento (e.g. anaeróbico) Somente usada razão

Complicação: Série em Tempo Medida a cada 2 horas por 10 horas (depleção de oxigênio) 31,000 razões da expressão de genes 6,200 diferentes gráficos com 5 pontos cada Alguns genes respondem de maneira igual a depleção de oxigênio?

Exemplo: mudança de ratios (razão) Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours Gene C 1 8 12 16 Gene D 3 4 2 Gene E Gene F 0.25 0.1 Gene G Gene H 0.5 0.33 Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N 0.125 0.0833 0.0625 Qual o padrão? Campbell & Heyer, 2003

Exemplo: transformação em log Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours Gene C 3 3.58 4 Gene D 1.58 2 1 Gene E Gene F -2 -3.32 Gene G Gene H -1 -1.60 Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N -3 -3.59 -4 Campbell & Heyer, 2003

Examplo: Coeficiente de Pearson Gene C Gene D Gene E Gene F Gene G Gene H Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N 1 0.94 0.96 -0.40 0.95 -0.95 0.41 0.36 0.23 -0.94 -1 0.84 -0.10 0.68 0.24 -0.07 -0.57 0.89 -0.89 0.21 0.30 0.43 -0.84 -0.96 -0.35 0.35 0.60 -0.43 -0.79 0.10 0.40 0.48 0.22 0.11 -0.48 -0.21 -0.11 -0.75 -0.68 -0.41 -0.24 -0.36 0.07 -0.23 Campbell & Heyer, 2003

Exemplo: reorganização de dados Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours Gene M 1 0.33 0.25 0.5 Gene N 0.125 0.0833 0.0625 Gene H Gene K 3 Gene J 2 Gene E 4 8 Gene C 12 16 Gene L Gene G Gene D Gene I Gene F 0.1 Campbell & Heyer, 2003

Exemplo: Campbell & Heyer, 2003

Genoma inteiro do fungo Campbell & Heyer, 2003

Tecnologia do DNA Microarray

DNA Microarrays

O que é Microarray? Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido de forma ordenada.

PAra que é utilizado? Análise de expressão Genotipagem de SNP Profile de cromatina Identificação de inserções Análise de metilação de DNA

Por que usar Microaaray para análise de expressão? Análises de expressão convencionais somente permite o estudo de um gene em um experimento Permite o estudo da expressão de milhares de genes em um único experimento Permite a análise da expressão global de genes o que não é possível em técnicas convencionais

Análise de Expressão Convencional RNA Control Cells Treated Cells RNA Electrophoresis and Blotting Hybridization Labeled probe – gene “X”

Análise de expressão usando Microarray RNA Control Cells Treated Cells RNA Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize, wash, and scan Microarray containing 16 probes

Tipos de Microarrays Spotted Arrays Affymetrix cDNA ou DNA genômico Oligonucleotídeos Affymetrix

Spotted Arrays Affymetrix Arrays Homemade Desenhado Mais barato? Máximo de 24.000 análises por experimento Susceptível a variabilidade Disponível comercialmente Definido anteriormente Mais caro????? Maximo de 500.000 análises por experimento Menos variável

Produção de Spotted Arrays Sondas de DNA preparadas em placas de 384 Lâminas de vidro compradas comercialmente ou homemade mesmo Arrays são spoted com um robô comercial Replicatas Controles

Spotted Array Printing Sonicator Water bath Sonicate Pick up Wash Print 384-well plate 1” x 3” glass slide

Spotted Array Printing Sonicator Water bath Sonicate Pick up Wash Print 384-well plate 1” x 3” glass slide

Preparação da amostra alvo, marcação, hibridização, scaning e aquisição de dados Isolamento de RNA Total RNA mRNA Transcrição reversa Marcação Hibridização e lavagem Scaning

RNA cDNA Isolate RNA Reverse transcription Label with Cy3 Treated Cells Control Isolate RNA RNA Reverse transcription cDNA Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize Microarray containing 16 probes Wash and Scan

Bibliografia Hedge, P., et al. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques 29, 548-562 (2000). Lipshutz, R.J., et al. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics Supplement 21, 20-24 (1999). Pritchard, C.C., Project normal: Defining normal variance in mouse gene expression. PNAS 98, 13266-13271 (2001).